Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
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Wir sind sehr dankbar für die Mitarbeiter von der Elektronenmikroskopie Kern Einrichtungen (EFWZ) am EMBL (Heidelberg) und an der Universität Heidelberg. Wir möchte Danke Ulrike Herian, Stephanie Kallis und Andrea Hellwig (Universität Heidelberg), sowie Eberhardt Schmidt und Renate Kunz (Universität Ulm) für kompetente technische Unterstützung. Arbeit von r.b. und sein Team (U.H. und I.R-b) wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 und TRR83, TP13 unterstützt.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die CLEM Methodik hier vorgestellt, um die Auswirkungen der ein virales Protein-Expression auf Zellmembranen zu studieren wird erfolgreich eingesetzt, bevor um die HCV-Replikation-assoziierten erhellen Strukturen, vor allem Doppelmembran Vesikel (DMVs)21, sowie zu Ermitteln Sie die kritische Bausteine erforderlich, um diese HCV-induzierten Strukturen23bilden. Beachten Sie, dass in unserer ersten Arbeit mit CLEM HCV-Replikation21zu studieren, eine leicht modifizierte Version des Protokolls, die hier beschriebenen angewendet wurde. In diesem konventionellen 0,05 mm dicken Saphir Disks ohne alphanumerische Muster-Studie dienten in dem ein Referenzmuster entstand durch Kohlenstoff Beschichten sie mit einem Finder Raster an der Spitze (siehe Tabelle der Materialien). Diese Version des aktuellen Protokolls kann schließlich mit dem Vorteil angewendet werden, dass die "A" Träger für HPF direkt, ohne die Notwendigkeit der Senkung wie in Abbildung 3Averwendet werden kann. Alternativ, wie im Protokoll erwähnt, ein dicker "A" Träger genutzt werden (siehe Tabelle der Materialien) mit gemusterten Saphir Scheiben, ohne die Notwendigkeit eines Trägers "B".
Interessanterweise kann dieses Protokoll angewendet werden, nicht nur BSL-1 Proben zu studieren, wie Zellen mit viralen Proteinen wie beschrieben hier und anderswo19,23transfiziert, sondern auch um infizierte Zellen zu studieren. Obwohl arbeiten mit humanpathogenen Labors BSL-2 und BSL-3 in der Regel beschränkt, in einigen Ländern ist es noch möglich, Cryo-Immobilisierung unter diesen biologischen Bedingungen durchzuführen. In den BSL-2 und BSL-3 Labors wo Verglasung nicht möglich, da die örtlichen Vorschriften oder das Fehlen einer HPF-Maschine ist können virusinfizierte Zellen noch vorbereitet zu sein mit dieser Methode, wenn chemische Fixierung mit Aldehyden im voraus durchgeführt wird, nämlich vor der Abreise der BSL-2 oder BSL-3 Einrichtungen. Darüber hinaus müssen Aldehyde abgeschreckt werden, sofort nach der Fixierung die Fluoreszenz zu halten, während der Rest des Protokolls mit dem hier beschriebenen identisch ist. Diese Technik kann überflüssig angesehen werden, weil die Zellen zweimal, chemisch und über Verglasung befestigt sind. Dieses doppelte Fixierung Protokoll führt jedoch in der Tat um einen viel besseren Schutz der HCV-induzierte DMVs im Vergleich zu der DMVs in den Zellen chemische Fixierung allein21ausgesetzt gefunden.
Weitere Modifikationen und Fehlerbehebung des Lesers bezeichnet man die Noten während des Protokoll-Teils dieser Handschrift. Diese Hinweise beschreiben Fallstricke zu vermeiden, sowie Alternativen zur vermeintliche Schwierigkeiten zu überwinden, die entstehen könnten, wenn diese Methode durchführen.
Die wichtigste Voraussetzung für die Anwendung dieser Technik ist eine HPF-Maschine. Wenn Zellen Cryo-Immobilisierung der Zellen über HPF ist nicht möglich (aufgrund des Fehlens einer HPF-Maschine) oder nicht erforderlich ist (wenn die Membran Erhaltung nicht optimal sein muss), kann durch EM8chemisch fixiert und anschließend vorbereitet und analysiert werden, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Diese Option erfordert nicht die Verwendung von Saphir Scheiben, aber Zelle Kultur Gerichte mit gerasterten Mustern für Zellen oder zellcluster verlagern. Der Hauptvorteil des Einsatzes dieser Gerichte ist ihre größeren Durchmesser im Vergleich zu Saphir Scheiben, so dass das Screening von größeren Flächen. So hat die Anwendung dieses Protokolls CLEM erfolgreich die Wirkung von eine antivirale Substanz gegen HCV15 studieren oder visualisieren Sie die Membran-Rearrangements induziert durch die Elementoptionen Proteine von Noroviren19angewendet. Ein weiteres Problem, das die Leistung dieser Methode einschränken kann ist das Fehlen eines kommerziellen FS-Geräts. In diesem Fall können hausgemachte FS Basissysteme stattdessen genutzt werden. Obwohl automatische FS-Geräte Umgang mit Pannen reduzieren könnte, werden hausgemachte Geräte erfolgreich zum Beispiel in Kent McDonalds30 und Paul Walthers Labors eingesetzt.
In Bezug auf chemische Fixierung das hier beschriebene Protokoll sorgt für eine optimale Konservierung der intrazellulären Strukturen20. Für den Fall, dass die oben genannten HPF und FS-Geräte zur Verfügung stehen, wäre einzufrieren die Zellen von Interesse bevorzugt daher.
Zukünftige Alternativen zu dieser CLEM Ansatz gehört die Möglichkeit der Anwendung dieser Methode nicht nur 2D-Informationen Ultrastrukturforschung Ebene zu erwerben, sondern auch 3D Informationen über die Architektur von Membran und Organelle Veränderungen durch Viren zu gewinnen. Die 3D-EM-Methoden, einschließlich Elektron Tomographie (ET) und fokussierte Ion Beam scanning-Elektronenmikroskopie (FIB-SEM) (ausführlich beschrieben in29), könnte auch auf Zellen angewendet werden, die nach dieser aktuellen Protokoll21vorbereitet wurden, 31. 3D-Informationen konnte darüber hinaus auch die Ebene der LM abgerufen werden, bei einem confocal Mikroskop ermöglicht den Erwerb von Z-Stapel. Diese Option ist in der Tat dringend empfohlen, wenn eine exakte Korrelation zwischen LM und EM Datasets gewünschte (siehe zum Beispiel17). Die Angaben in 3D Z-Stapel-Aids, die Korrelation mit der 2D TEM Bilder zu verbessern. So, in einem solchen Szenario am besten passende LM und EM Bilder werden ausgewählt und können dann eines der Korrelation-Software zur Verfügung, wie z. B. die EG-CLEM Plugin von ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 oder das Wahrzeichen Korrespondenzen Plugin von unterworfen Bild J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), was die Generation der überlappende LM-EM Bilder.
Wenn zeitliche Informationen benötigt werden, die Kinetik der ein bestimmtes Ereignis zu verstehen, kann Zeitraffer Bildgebung zur Dynamik von lebenden Zellen in Kombination mit EM zu überwachen. Während der Veranstaltung von Interesse sind Zellen sofort fixiert, generieren eine "gefrorene Momentaufnahme", die anschließend über EM analysiert werden können, den detaillierten Ultrastrukturforschung Informationen über diesen besonderen Moment zum Zeitpunkt der Immobilisierung. Um diese "gefrorene Momentaufnahme", nach der Beobachtung in Echtzeit zu erhalten, können Zellen entweder chemisch festen33 oder Cryo immobilisiert6sein. Da viele zelluläre Prozesse schneller als die Diffusionsvorgänge chemische Fixierung auftreten, sollte wenn möglich, Ultra-schnelles Gefrieren durchgeführt werden. Allerdings ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die HPF-Maschinen in ihre effektive Auflösung34unterscheiden.
Obwohl dieses Protokoll für die Einbettung von Zellen in einem Epoxidharz entworfen wurde, können Zellen darüber hinaus auch in niedrigviskose Harze, wie Lowicryls, LR weiß oder LR Gold eingebettet. Die Verwendung dieser Einbettung Medien ermöglicht die Antigenität35,36, sowie Fluoreszenz37,38 zu bewahren und sind daher hauptsächlich für die Post-Einbettung auf Abschnitt Immunolabeling39 , 40 und auf Abschnitt CLEM41,42,43,44, wo die LM nach der Einbettung erfolgt. Beide Ansätze (Immuno-EM und auf Abschnitt CLEM) müssen für diese Experimente entscheidend sein in denen nicht-Charakteristik Strukturen leicht per TEM und/oder als Kontrolle gegen Miscorrelation LM bis EM Signale gefunden werden können. Ebenso Kennzeichnung mit Antikörpern, die durch beide bildgebenden Verfahren (LM und EM) sichtbar gemacht werden können vorgenommen werden45 um, z. B. transfizierte Zellen in LM (Pre-Einbettung Bühne) und erreichen eine viel genauere Lokalisierung von der GFP-Signal über seine spezifischen Kennzeichnung durch Immuno-EM (Post-Einbettungs-Stadium). Muss berücksichtigt werden, jedoch erfolgt die Permeabilisierung vor LM erlauben den Zugang von Antikörpern gegen den intrazellulären Raum, was eine Sub-optimale Erhaltung der Zellarchitektur auf EM Niveau führen kann. Interessant ist, dieses Protokoll eignet sich auch gut für Multi-Color, die Experimente lässt sich mit dem Einsatz anderer fluoreszierende Tags als GFP (wie hier gezeigt). Zusammenfassend gibt es viele vermeintliche Möglichkeiten der Anpassung dieses Protokolls auf die LM bzw. an den EM-Seiten, je nach Fragestellung, die in Angriff genommen werden. Eine umfassende Beschreibung der anderen alternativen Protokollen wird bis5,46verwiesen. Unabhängig davon, wie die Mikroskopie-Modalitäten kombiniert werden ergibt zusammen einen Zugewinn an Information, ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie Viren und ihre Proteine mit ihren Gastgebern im wirklichen Leben interagieren.
Die wichtigste Schritt innerhalb dieser Methode ist die Sammlung von Schnittserien aus den Zellen von Interesse. Wie in Abschnitt repräsentative Ergebnisse hervorgehoben erfordert dies fachkundiges Personal sowie viel Geduld. Wichtig ist, ist dieser Schritt wichtig, die Zellen wieder auf dem Niveau der EM aus zwei Gründen zu finden. Erstens sind in dieser Art von CLEM Protokoll mit Pre LM einbetten, die Koordinaten nur sichtbar auf der LM-Ebene und auf dem Harz Block Gesicht nach der Einbettung. Allerdings werden sie nicht auf den Abschnitten durch TEM sichtbar. Gezielte Trimmen auf dem Block nach unten in die Regionen von Interesse (ROIs) muss daher sorgfältig durchgeführt werden, mit einer Rasierklinge um sicherzustellen, dass die Abschnitte, die nachträglich erlangt werden die Zellen mit dem Ausdruck einer bestimmten FP enthalten. Zweitens ist es notwendig, die beste Überlagerung zwischen den LM und die EM-Akquisitionen zu finden, "Scannen" mehrere Abschnitte. Im Gegensatz zu Methoden, wo LM in der Post-Einbettung Stadium durchgeführt wird, ist in diesem Fall das LM-EM-Overlay nicht so genau. Die geringe Überlagerung Genauigkeit ist aufgrund der Unterschiede in axiale Auflösung zwischen LM und EM, Schrumpfung während der Probenverarbeitung von EM und Kompression während42-Schnitt. Dennoch helfen effizientes Tracking-Methoden wie der Einsatz von Sehenswürdigkeiten, die Zellen wieder zu finden. Dazu gehören die Position von einer Zelle zur anderen, sowie die Form der Zellen und deren Kern. In diesem Zusammenhang informieren wie in dem Protokoll, DIC-Bilder "anatomischen" der Zellen, die die Korrelation zu verbessern sind. Alternativ die Zellkerne oder andere gut erkennbar Zellorganellen (z. B. Mitochondrien oder Lipid Tröpfchen) vor LM gebeizt und als Landmarken verwendet werden können.
Schließlich ist es bemerkenswert zu erwähnen, dass obwohl diese Handschrift über den Einsatz dieser Technik für Virologie Studien ausgerichtet ist, der Anwendungsbereich dieser Versuchsanordnung erweitert werden kann, um allgemeine biologische Fragen beantworten.

Die Idee der Kombination von zwei Mikroskopie Modalitäten, ein besseres Bild von einem bestimmten biologischen Prozess zu erhalten ist ziemlich alt. So erschien die erste Studie über Viren, die mit "Korrelative Mikroskopie" im Jahr 1960 als zwei separate Publikationen1,2. In dieser Studie analysiert die Autoren die Änderungen in der Morphologie des Kerns durch Adenoviren mittels zwei mikroskopiertechniken induziert. In der ersten Publikation wurden Elektronenmikroskopie (EM) Beobachtungen beschreiben die morphologischen Einzelheiten im Zusammenhang mit Adenovirus-Infektion gemeldeten1. In einer zweiten Publikation wurden die verschiedenen Strukturen von EM beobachtet korreliert mit Lichtmikroskopie (LM) Bilder von histochemische Färbung Mustern, die Natur der zuvor beobachtet von EM2Strukturen zu definieren.
In diesen frühen Studien wurden jedoch ihre Beobachtungen mit verschiedenen infizierten Zellen, die als unabhängige Experimente durchgeführt. Die "Korrelation", in der Tat sollte als die Kombination von Informationen aus zwei bildgebender Verfahren zu verstehen, ein bestimmtes Phänomen, vergleicht man die Ergebnisse, die mit verschiedenen Assays gewonnen worden sein, um zu verstehen, ein bestimmtes biologisches Prozesses.
Heutzutage wird der Begriff Korrelative Mikroskopie, auch bekannt als Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), auf eine wachsende Zahl von Methoden (rezensiert in Referenzen3,4,5), mit der Gemeinsamkeit angewendet. dass beide bildgebenden Verfahren (LM und EM) auf der selben Probe durchgeführt werden. Die Kombination beider Methoden ergibt sich dabei in einer multi-modale, Multi-Skalen und Multi-dimensionale Analyse von diesem Beispiel3. Die Vorteile sind, dass LM kann eine umfassende Übersicht über viele verschiedene Zellen ermöglicht die Identifizierung der Zelle Subpopulationen mit dem Ausdruck eines Proteins oder in eine heterogene Zellpopulation interessierender Proteine. EM überwindet die Auflösungsgrenze des LM, bietet eine höhere Auflösung Bild eines bestimmten Ereignisses intrazellulären. Darüber hinaus ermöglicht EM die Visualisierung des nicht-fluoreszierende subzelluläre Kontexts, einschließlich aller Membran gebunden Organellen, große makromolekulare Komplexe (z. B. Ribosomen, Centriolen, etc.) und Zytoskeletts Elemente, damit Bereitstellung von räumlichen Zusatzinformationen, die so genannte "Referenz Raum"6und fluoreszierende Ort erkannt durch LM Rahmen verleihen.
CLEM geworden in den letzten Jahren ein leistungsfähiges Werkzeug nicht nur für Zelle Biologen5, sondern auch für Virologen (rezensiert in Referenz7) bereit, die komplexe Virus-Zell-Interaktionen zu verstehen, die für eine erfolgreiche Virus-Verbreitung führen. Deshalb verstehen wie Viren Zellmembranen und Organellen zu ihren eigenen Gunsten ändern entscheidend für die Entwicklung von antiviraler Medikamenten um pathogene Viren auszurotten.
Hier wird ein CLEM Verfahren beschrieben, das ermöglicht die Erkennung von LM von Zellen mit dem Ausdruck virale Proteine mit einem fluoreszierenden Proteins (FP) verschmolzen. Diese Zellen sind anschließend Cryo-immobilisiert und weitere bereit für Ultrastrukturforschung Analyse über die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), neue Einblicke in die Expression dieser Proteine ordnen wie intrazelluläre Membranen (Abbildung 1). CLEM wurde mit chemisch festen Zellen in den meisten der Virologie Studien veröffentlicht bis Datum8,9,10,11,12,13,14 durchgeführt ,15,16,17,18,19. Dies ist vor allem wegen der Notwendigkeit der Inaktivierung infektiösen Materials aus biologischen Gründen Biosafety Level-2 und-3 (BSL-2 und BSL-3) Labors, wo die Cryo-Immobilisierung von Zellen in der Regel nicht möglich ist. Für diese Fragen erfordern eine optimale Konservierung der Zellmembranen, Verglasung über Hochdruck Einfrieren (HPF) jedoch20empfiehlt. In diesen Fällen kann die hier beschriebene CLEM Protokoll angewendet werden. Interessanterweise kann vor allem beim Arbeiten mit infektiösen Proben HPF auf Proben durchgeführt werden, die zuvor chemisch inaktiviert, zum Beispiel in Labors BSL-2 und BSL-3 gewesen sein. Die Kombination von chemischen Fixierung gefolgt von HPF ist eine Möglichkeit, zumindest teilweise profitieren Sie von den Vorteilen der Kryokonservierung Methoden21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Workflows für die Analyse der Zellen durch CLEM. Zellen wachsen auf gemusterte Saphir Scheiben werden zunächst durch LM, Zellen mit dem Ausdruck FPs vor deren Verarbeitung für EM zu lokalisieren analysiert. Sobald diese gefunden ist, werden Zellen von HPF und FS anschließend in Harz eingebettet werden sofort behoben. Bei der Polymerisation des Harzes, die Unterstützung, wo Zellen wuchsen (= Saphire Scheiben) muss aus dem Harz-Block entfernt werden. Der Block mit den eingebetteten Zellen ist auf ein kleines Trapez getrimmt aus dem verbleibenden Zellen, mit dem Ausdruck FPs, mit einem Diamant-Messer geschnitten werden. Ultradünnen Abschnitte auf Slot Gittern gesammelt und weiter durch TEM Ultrastrukturforschung Informationen dieser Zellen zu untersuchen. Diese Zahl ist angepasst und mit freundlicher Genehmigung von Verweis29geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

Aufgrund der hohen Auflösung ist Elektronenmikroskopie (EM) ein unverzichtbares Werkzeug für Virologen. Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Analyse von Virus-infizierten oder transfizierten Zellen über EM sind jedoch die niedrigen Wirkungsgrade von Infektion oder Transfektion, behindern die Prüfung dieser Zellen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, kann Lichtmikroskopie (LM) zuerst ausgeführt werden, um die Subpopulation von infizierten oder transfizierten Zellen zuzuordnen. So nutzen die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen (FPs), virale Proteine verschmolzen, LM wird hier verwendet, um die Positionen der "positiv-transfizierten" Zellen aufnehmen, mit dem Ausdruck ein FP und wächst auf einem Träger mit einem alphanumerischen Muster. Anschließend Zellen weiterverarbeitet werden für EM über Hochdruck (HPF) Einfrieren, Einfrieren, Substitution (FS) und Harz einbetten. Der Ultra-schnelle einfrierende Schritt sorgt für ausgezeichnete Membran Erhaltung der ausgewählten Zellen, die dann auf der Ultrastrukturforschung Ebene mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) analysiert werden kann. Hier ist ein Schritt für Schritt Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Workflow vorgesehen, Probenvorbereitung, Bildgebung und Korrelation im Detail zu beschreiben. Das experimentelle Design kann auch angewendet werden, um viele Zelle Biologie Fragen beantworten.

Mithilfe der hier vorgestellten Verfahren (Abbildung 1), Huh7 Lunet Zellen auf gemusterte Saphire Discs entkernt und anschließend mit einem Plasmid mit dem Ausdruck zwei Domänen des Hepatitis C-Virus (HCV) transfiziert wurden stabil auszudrücken die T7-RNA-polymerase Elementoptionen Protein NS5A, getaggt mit GFP (pTM_AH-D1-GLP) (Abbildung 4). Am Folgetag wurden die gemusterten Saphiren Scheiben, wo die Zellen wuchsen, die Zelle Kultur Gerichte entzogen und abgebildet durch LM (Abbildung 4, Abbildung 2). Diese Zellen mit dem Ausdruck der GFP-D1-AH waren gekennzeichnet durch das Vorhandensein von grünen Fluoreszenz in der Zellflüssigkeit und aufgezeichnet, um ihre Positionen innerhalb der Koordinate-Muster der Saphiren Scheiben (Figuren 5A, 5 b) speichern. Unmittelbar nach deren LM-Prüfung, der Saphir CDs mit den Zellen von Interesse waren zwischen zwei Aluminium-Träger (Abbildung 3) montiert und Cryo-Immobilisierung durch HPF ausgesetzt. Zellen wurden dann Einfrieren, ersetzt und anschließend in ein Epoxidharz eingebettet.
Nach dem Entfernen der Saphiren Scheiben aus polymerisierten Harz-Blöcken war der Abdruck des Musters alphanumerische sichtbar auf den Block-Gesicht, das erlaubt, Abrufen von den Bereichen, wo die Zellen von Interesse waren. Der Rest des Blocks Harz war Weg getrimmt, um ein kleines Trapez beherbergen die Zellen von Interesse zu erzeugen. Ultradünne Schnittserien wurden aus diesem Trapez, gesammelt auf EM Slot Gittern und weiter durch TEM (Abbildung 5C) analysiert. Beachten Sie, dass manuell Schnittserien in Folge zu erhalten, obwohl machbar28 ist arbeitsintensiv und gut ausgebildete und qualifizierte Personal erfordert. Es ist auch wichtig, dass die Zellen verfügen über eine geringe Konfluenz bei CLEM Protokolls (Abb. 5A) unterzogen, um eine schnelle Erfassung der gleichen Zelle zuvor identifiziert durch LM zu gewährleisten. Andernfalls könnte mit höheren Zelle Konfluenz drastisch verlangsamen das erfolgreiche Auffinden von Zellen auf der Ebene der EM.
TEM Analyse mehrerer ultradünnen Abschnitte der Zelle von Interesse (Zahlen 5, 5E), mit dem Ausdruck der AH-D1-GFP, offenbart die Präsenz in den intrazellulären Raum große Ansammlungen von Vesikeln der Variable Morphologie abgegrenzt von der rund um Zytosol durch einen einzigen Lipid Bilayer (Abbildung 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Abbildung 4 : Schematische Darstellung des Workflows gefolgt auszuführenden CLEM Beispiel dargestellt Abbildung 5 . Huh7-Lunet Zellen stabil auszudrücken die T7-RNA-Polymerase mit einer DNA Plasmid Codierung der amphipathische Helix (AH) und der Domäne 1 (D1) von HCV NS5A Protein transfiziert wurden markiert an der C-terminalen mit GFP (pTM_AH-D1-GLP). Der Ausdruck dieses Teils des NS5A-Proteins ist transcriptionally durch ein T7-Promotor (T7 Pm) und translationally durch ein Enzephalomyocarditis Virus (EMCV) IRES (interne Ribosom Eintrag Website) Element, angezeigt durch eine sekundäre Struktur gesteuert. 24 h nach Transfektion (24 Hpt) Zellen wachsen auf gemusterten Saphire Scheiben und mit dem Ausdruck der AH-D1-GFP wurden von LM erkannt und unverzüglich HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Abbildung 5 : Beispiel für ein CLEM Verfahren. (A) Huh7 Lunet Zellen stabil auszudrücken die T7-Polymerase analysiert durch Fluoreszenz-Mikroskopie, GFP-positiven Zellen gewachsen auf gemusterte Saphir Scheiben, 24 h nach Transfektion mit dem Plasmid pTM_AH-D1-GFP bereitzustellen. (B) höhere Vergrößerung Bild aus einer einzigen Zelle in das weiße gestrichelte Rechteck ausgewählt von CLEM ausgewertet werden. (C) TEM Bild einer ultradünnen Abschnitt der gleichen Zelle nach HPF, FS und Harz einbetten. (D) schematische Darstellung der Schnittserien 70 nm ultradünnen auf einem Slot EM Raster enthält die Zelle von Interesse. (E) auf der linken Seite: TEM Übersichten über zwei Abschnitte der Zelle von Interesse. Auf der rechten Seite: hohe Vergrößerung TEM Bilder der intrazellulären Bereiche im gelben Rechtecke auf der linken Seite, zeigt hohe Zahl von Vesikeln aus dem Cytosol über eine einzelne Membran getrennt ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.

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