Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

हम EMBL (हीडलबर्ग) में और हीडलबर्ग विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर सुविधाओं (EMCF) के स्टाफ के सदस्यों के लिए बहुत आभारी हैं । हम भी Ulrike Herian, स्टेफ़नी कैलिस और Andrea Hellwig (हीडलबर्ग विश्वविद्यालय), के रूप में अच्छी तरह के रूप में Eberhardt श्मिट और renate Kunz विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए (उल्म विश्वविद्यालय) शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । R.B. और उनकी टीम (U.H. और I.R.-बी.) द्वारा काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 और TRR83, TP13 द्वारा समर्थित किया गया था ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

एक विशिष्ट जैविक प्रक्रिया की एक बेहतर तस्वीर प्राप्त करने के लिए दो माइक्रोस्कोपी मोडलों के संयोजन के विचार के बजाय पुराना है । इस प्रकार, "correlative माइक्रोस्कोपी" का उपयोग कर वायरस के बारे में बहुत पहले अध्ययन १९६० में दो अलग प्रकाशनों1,2के रूप में प्रकाशित किया गया था । उस अध्ययन में, लेखकों दो माइक्रोस्कोपी तकनीक के माध्यम से एडिनोवायरस द्वारा प्रेरित नाभिक की आकृति विज्ञान में परिवर्तन का विश्लेषण किया. प्रथम प्रकाशन में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) प्रेक्षणों को एडीनोवायरस संक्रमण से जुड़े रूपात्मक विवरण का वर्णन करते हुए1बताया गया. एक दूसरे प्रकाशन में, विभिंन संरचनाओं द्वारा मनाया उंहें प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) histochemical धुंधला पैटर्न के छवियों के साथ संबंधित थे, संरचनाओं की प्रकृति को परिभाषित करने के लिए पहले उंहें2द्वारा मनाया ।
इन प्रारंभिक अध्ययनों में, तथापि, स्वतंत्र प्रयोगों के रूप में तैयार विभिन्न संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करते हुए उनकी टिप्पणियों का प्रदर्शन किया गया. "सहसंबंध" था, वास्तव में, दो इमेजिंग विधियों से आ रही जानकारी के संयोजन के रूप में एक निश्चित घटना को समझने के लिए, सभी निष्कर्षों है कि विभिंन परख के साथ प्राप्त किया गया है क्रम में समझने के लिए एक जैविक दिया तुलना प्रक्रिया.
आजकल, शब्द correlative माइक्रोस्कोपी, भी correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) के रूप में जाना जाता है, विधियों की एक बढ़ती हुई संख्या के लिए लागू किया जाता है (संदर्भ में समीक्षित3,4,5), समानता के साथ कि दोनों इमेजिंग तकनीक (LM और उंहें) बाहर बहुत ही नमूना पर किए जाते हैं । दोनों तरीकों के परिणाम के संयोजन, इस प्रकार, एक बहु में, मॉडल, बहु पैमाने पर और उस नमूने3के बहु आयामी विश्लेषण । लाभ कर रहे है कि एल एम कई विभिंन कोशिकाओं का एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान कर सकते हैं, कोशिका उपजनसंख्या एक विषम कोशिका जनसंख्या के भीतर एक प्रोटीन या ब्याज की प्रोटीन व्यक्त की पहचान को सक्षम करने से । EM LM के संकल्प सीमा पर काबू पाता है, एक विशेष intracellular घटना की एक उच्च संकल्प छवि प्रदान करते हैं । इसके अलावा, EM गैर के दृश्य सक्षम बनाता है-फ्लोरोसेंट उपसेलुलर संदर्भ, सभी झिल्ली organelles बाध्य सहित, बड़े macromolecular परिसरों (जैसे, ribosomes, centrioles, आदि) और cytoskeletal तत्वों, जिससे अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान करना, तथाकथित "संदर्भ अंतरिक्ष"6, और फ्लोरोसेंट जगह LM द्वारा पता चला संदर्भ दे रही है ।
पिछले कुछ वर्षों के दौरान, भूखों न केवल सेल जीव5के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, लेकिन यह भी virologists के लिए (संदर्भ7में समीक्षा की) जटिल वायरस सेल बातचीत है कि एक सफल वायरस के प्रसार के लिए नेतृत्व को समझने के लिए तैयार । इस प्रकार, समझ कैसे वायरस कोशिका झिल्ली को संशोधित करने और अपने स्वयं के लाभ के लिए organelles एंटीवायरल दवाओं के विकास के लिए आवश्यक है रोगजनक वायरस के उंमूलन ।
यहां, एक भूखों विधि वर्णित है कि वायरल प्रोटीन एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफ पी) से जुड़े व्यक्त कोशिकाओं के एल एम द्वारा पता लगाने की अनुमति देता है । इन कोशिकाओं को बाद में क्रायो-मैटीरियल और आगे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) के माध्यम से ultrastructural विश्लेषण के लिए तैयार है कि कैसे इन प्रोटीन की अभिव्यक्ति intracellular झिल्ली (चित्रा 1) को पुनर्व्यवस्थित में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए । भूखों को दिनांक8,9,10,11,12,13,14 को प्रकाशित वायरोलॉजी अध्ययन के अधिकांश में रासायनिक निर्धारित कक्षों के साथ प्रदर्शन किया गया है ,15,16,17,18,19। यह मुख्य रूप से, क्रायो-2 और-3 (बीएसएल-2 और बीएसएल-3) प्रयोगशालाओं, जहां कोशिकाओं के स्थिरीकरण संभव नहीं है आमतौर पर के लिए सुरक्षा कारणों के लिए संक्रामक सामग्री को निष्क्रिय करने की जरूरत के कारण है । उन सवालों के लिए सेल झिल्ली के एक इष्टतम संरक्षण की आवश्यकता होती है, उच्च दबाव ठंड (HPF) के माध्यम से vitrification है, तथापि, उच्च20की सिफारिश की । इन मामलों में यहां बताए गए भूखों को प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है । दिलचस्प है, खासकर जब संक्रामक नमूनों के साथ काम कर रहे हैं, HPF नमूनों कि पहले रासायनिक निष्क्रिय किया गया है पर किया जा सकता है, उदाहरण के लिए बीएसएल में-2 और बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं । HPF के बाद रासायनिक निर्धारण के संयोजन से कम से आंशिक रूप से लाभ क्रायो के लाभ के लिए संभावना है-संरक्षण विधियों21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> चित्रा 1 : कार्यप्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भूखों । पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं को पहले एल एम द्वारा विश्लेषण कर रहे है उंहें EM के लिए अपने प्रसंस्करण से पहले एफपीएस व्यक्त कोशिकाओं स्थानीयकृत । एक बार स्थित है, कोशिकाओं को तुरंत HPF और एफएस द्वारा तय कर रहे है बाद में राल में एंबेडेड हो । राल के बहुलकीकरण पर, समर्थन जहां कोशिकाओं (= नीलमणि डिस्क) बढ़ रहे थे राल ब्लॉक से हटा दिया जाना चाहिए । ब्लॉक एंबेडेड कोशिकाओं से युक्त एक छोटे trapezium जिसमें से शेष कोशिकाओं, एफपीएस व्यक्त करने के लिए छंटनी की है, एक हीरे चाकू के साथ खोदी हैं । Ultrathin वर्गों स्लॉट ग्रिड पर एकत्र कर रहे है और आगे उनि द्वारा जांच के लिए इन कोशिकाओं के ultrastructural जानकारी प्राप्त करते हैं । यह आंकड़ा अनुकूलित और29संदर्भ से अनुमति के साथ संशोधित किया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

अपने उच्च संकल्प के कारण, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) virologists के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है । हालांकि, मुख्य कठिनाइयों का विश्लेषण जब उंहें वायरस संक्रमित या transfected कोशिकाओं के माध्यम से उंहें संक्रमण या अभिकर्मक की कम क्षमता है, इन कोशिकाओं की परीक्षा में बाधा । इस कठिनाई को दूर करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) पहले संक्रमित या transfected कोशिकाओं के उपजनसंख्या आवंटित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । इस प्रकार, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग का लाभ लेने (एफपीएस) वायरल प्रोटीन से जुड़े, LM यहां प्रयोग किया जाता है "सकारात्मक-transfected" कोशिकाओं की स्थिति को रिकॉर्ड करने के लिए, एक FP व्यक्त और एक अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न के साथ एक समर्थन पर बढ़ रही है । बाद में, कोशिकाओं को आगे उच्च दबाव ठंड (HPF), फ्रीज प्रतिस्थापन (एफएस) और राल embedding के माध्यम से उंहें के लिए संसाधित कर रहे हैं । अल्ट्रा तेजी से ठंड कदम चयनित कोशिकाओं है कि तब संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा ultrastructural स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता है की उत्कृष्ट झिल्ली संरक्षण सुनिश्चित करता है । यहाँ, एक कदम दर कदम correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) कार्यप्रवाह प्रदान की जाती है, विस्तार में नमूना तैयारी, इमेजिंग और सहसंबंध का वर्णन. प्रायोगिक डिजाइन भी कई सेल जीव विज्ञान के सवालों के समाधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना (चित्रा 1), Huh7-Lunet की कोशिकाओं को छुरा T7-आरएनए पोलीमरेज़ व्यक्त पैटर्न नीलमणि डिस्क पर वरीयता प्राप्त थे और बाद में एक transfected के साथ प्लाज्मिड हेपेटाइटिस सी वायरस (HCV) के दो डोमेन व्यक्त गैर संरचनात्मक प्रोटीन NS5A, GFP के साथ टैग (pTM_AH-D1-GFP) (चित्रा 4) । अगले दिन, नमूनों नीलमणि डिस्क, जहां कोशिकाओं बढ़ रहे थे, सेल संस्कृति व्यंजन से बाहर ले जाया गया और एल एम के माध्यम से imaged (4 चित्रा, चित्रा 2) । उन कोशिकाओं को व्यक्त आह-D1-GFP cytosol में हरे प्रतिदीप्ति की उपस्थिति द्वारा की पहचान की और समंवय-नीलमणि डिस्क (आंकड़े 5, 5B) के पैटर्न के भीतर अपनी स्थिति को बचाने के लिए दर्ज किया गया । तुरंत उनके LM परीक्षा के बाद, नीलमणि डिस्क ब्याज की कोशिकाओं से युक्त दो एल्यूमीनियम वाहक (चित्रा 3) और HPF द्वारा क्रायो-स्थिरीकरण के अधीन इकट्ठे हुए थे । कोशिकाओं तो प्रतिस्थापित और बाद में एक epoxy राल में एंबेडेड फ्रीज थे ।
बहुलक राल ब्लॉकों से नीलमणि डिस्क को हटाने पर, अल्फ़ांयूमेरिक पैटर्न की छाप ब्लॉक चेहरे पर दिखाई दे रहा था, जो उन क्षेत्रों को पुनः प्राप्त करने की अनुमति देता है जहां ब्याज की कोशिकाएं स्थित थीं । राल ब्लॉक के बाकी दूर छंटनी के लिए एक छोटे से ब्याज की कोशिकाओं बंदरगाह trapezium उत्पंन किया गया । धारावाहिक ultrathin वर्गों इस trapezium से प्राप्त किया गया था, EM स्लॉट ग्रिड पर एकत्र और आगे उनि द्वारा विश्लेषण (चित्रा 5सी). ध्यान दें कि मैंयुअल रूप से क्रमिक वर्गों प्राप्त करने हालांकि संभव28 श्रम गहन है और अच्छी तरह से प्रशिक्षित और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है । यह भी महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को एक कम प्रवाह है जब इस भूखों प्रोटोकॉल (चित्रा 5ए) के अधीन आदेश में एक ही सेल पहले LM द्वारा की पहचान की एक त्वरित मांयता की गारंटी है । अंयथा, उच्च कोशिका प्रवाह होने नाटकीय रूप से नीचे EM स्तर पर कोशिकाओं का पता लगाने के सफल धीमा हो सकता है ।
हित के सेल के कई ultrathin वर्गों के उनि विश्लेषण (आंकड़े 5d, 5E), आह-D1-GFP व्यक्त, चर आकृति विज्ञान के बुलबुले के बड़े संचय के अपने intracellular अंतरिक्ष में उपस्थिति से पता चला एक एकल लिपिड bilayer द्वारा cytosol आसपास (चित्रा 5ई).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> चित्र 4 : कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व भूखों में चित्रित उदाहरण प्रदर्शन करने के लिए पीछा किया चित्रा 5 . Huh7-Lunet कोशिकाओं T7-आरएनए पोलीमरेज़ व्यक्त डीएनए transfected प्लाज्मिड (amphipathic-d1-HCV) के साथ अपने C-टर्मिनल पर टैग (आह) और NS5A प्रोटीन का डोमेन 1 (D1) एंकोडिंग GFP के साथ pTM_AH थे । NS5A प्रोटीन के इस भाग की अभिव्यक्ति एक T7 प्रवर्तक द्वारा transcriptionally नियंत्रित किया जाता है (T7 प्रधानमंत्री) और एक encephalomyocarditis वायरस (EMCV) आयरेस (आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट) तत्व द्वारा अनुवाद, एक द्वितीयक संरचना द्वारा संकेत दिया । चौबीस एच पोस्ट-अभिकर्मक (24 hpt) पैटर्न नीलमणि डिस्क पर बढ़ रही कोशिकाओं और आह-D1-GFP एक्सप्रेस LM द्वारा पता लगाया गया और तुरंत HPF-FS के अधीन थे । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> चित्रा 5 : एक भूखों की प्रक्रिया का उदाहरण । (क) Huh7-Lunet कोशिकाओं को छुरा प्रतिदीप्ति GFP-D1-अभिकर्मक के साथ प्लाज्मिड के बाद pTM_AH-सकारात्मक कोशिकाओं patterned नीलमणि डिस्क पर उगाए आबंटित करने के लिए, T7 पोलीमरेज़ द्वारा विश्लेषण किया है । (ख) भूखों द्वारा विश्लेषण किए जाने के लिए सफ़ेद डैश्ड आयत के भीतर चयनित एकल कक्ष की उच्चतर आवर्धन छवि । (ग) HPF, एफएस और राल embedding के बाद एक ही सेल के एक ultrathin अनुभाग के उनि छवि । (घ) धारावाहिक ७० के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-एनएम ultrathin वर्गों एक स्लॉट EM ब्याज की कोशिका युक्त ग्रिड पर । (ङ) बाईं ओर: उनि हित के प्रकोष्ठ के दो वर्गों का अवलोकन. दाईं ओर: बाईं तरफ पीले आयतों में चयनित intracellular क्षेत्रों के उच्च आवर्धन उनि छवियों, एक एकल झिल्ली के माध्यम से cytosol से सीमांकित बुलबुले की उच्च संख्या का खुलासा । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

ट्रैकिंग और इमेजिंग के लिए Correlative लाइट इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) क्रायो-मैटीरियल कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन संबद्ध संरचनाओं

एक correlative प्रकाश इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों) विधि पहले प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) द्वारा चयनित कर रहे हैं कोशिकाओं में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के माध्यम से छवि वायरस प्रेरित intracellular संरचनाओं के लिए लागू किया जाता है. एल एम और EM एक संकर इमेजिंग दृष्टिकोण के रूप में संयुक्त करने के लिए वायरस की एक एकीकृत दृश्य-मेजबान बातचीत को प्राप्त कर रहे हैं ।

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

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Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

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तीन आयामी ऑप्टिकल संकल्प Photoacoustic माइक्रोस्कोपी

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