Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Siamo molto grati ai membri del personale di microscopia elettronica Core Facilities (FECOM) all'EMBL (Heidelberg) e presso l'Università di Heidelberg. Inoltre vorremmo ringraziare Ulrike Herian, Stephanie Kallis e Andrea Hellwig (Università di Heidelberg), così come Eberhardt Schmidt e Renate Kunz (Università di Ulm) per assistenza tecnica. Lavoro di R.B. e il suo team (U.H. e I.R.-B.) è stato sostenuto dal Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TRR83, TP13 e TP11.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La metodologia di CLEM ha presentata qui a studiare l'impatto di un'espressione di proteina virale sulle membrane cellulari è stata utilizzata con successo prima per delucidare l'HCV associata replica strutture, principalmente doppia membrana vescicole (DMV)21, come pure per determinare i blocchi di edificio critici necessari per formare queste strutture indotta da HCV23. Si noti che nel nostro primo lavoro usando CLEM per studiare HCV replica21, una versione leggermente modificata del protocollo descritto qui è stata applicata. In quanto Studio, spessore dischi zaffiro convenzionale 0,05 mm, senza modello alfanumerico, sono stati utilizzati in cui un modello di riferimento è stato creato da carbonio rivestimento li con una griglia di finder sulla parte superiore (Vedi Tabella materiali). Questa versione del protocollo corrente può essere applicata alla fine, con il vantaggio che il "Un" vettore per HPF sono utilizzabili direttamente, senza la necessità di taglio basso come in Figura 3A. In alternativa, come indicato nel protocollo, una più spessa "Un" vettore può essere utilizzata (Vedi Tabella materiali) con dischi in zaffiro fantasia, senza la necessità di un elemento portante "B".
Interessante, questo protocollo può essere applicato non solo studiare campioni di BSL-1, come le cellule transfected con proteine virali come descritto qui e altrove19,23, ma anche di studiare le cellule infettate da virus. Anche se lavoro con agenti patogeni umani è solitamente limitato ai laboratori BSL-2 e BSL-3, in alcuni paesi è ancora possibile effettuare cryo-immobilizzazione in queste condizioni di biosicurezza. In quei BSL-2 e laboratori BSL-3 dove non è possibile, a causa di regolamenti locali o l'assenza di una macchina di HPF vetrificazione, cellule infettate da virus possono essere ancora preparate utilizzando questo metodo, se la fissazione chimica con aldeidi è effettuata in anticipo, vale a dire prima di lasciare le strutture BSL-2 o BSL-3. Inoltre, aldeidi devono essere raffreddato immediatamente dopo la fissazione per mantenere la fluorescenza, mentre il resto del protocollo è identico a quello descritto qui. Questa tecnica può essere considerata ridondante perché le cellule sono fissate due volte, chimicamente e tramite vetrificazione. Tuttavia, questo protocollo di fissazione doppia porta infatti a una molto migliore conservazione del DMV HCV-indotto in confronto il DMV trovata in cellule sottoposte a fissazione chimica solo21.
Per ulteriori modifiche e la risoluzione dei problemi il lettore si riferisce alle note in tutta la parte di protocollo di questo manoscritto. Queste note descrivono insidie da evitare, come pure delle alternative a superare presunte difficoltà che potrebbero sorgere durante l'esecuzione di questo metodo.
Il requisito principale per l'applicazione di questa tecnica è una macchina di HPF. Quando cryo-immobilizzare le cellule via HPF non è fattibile (a causa dell'assenza di una macchina di HPF) o non richiesto (quando la conservazione di membrana non deve necessariamente essere ottimale), le cellule possa essere chimicamente fisso e successivamente preparati e analizzati da EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Questa opzione non richiede l'uso di dischi in zaffiro, ma piastre di coltura cellulare con i modelli di griglia per lo spostamento di celle o gruppi di cellule. Il vantaggio principale dell'uso di questi piatti è il loro diametro maggiore rispetto ai dischi in zaffiro, che permette la proiezione di grandi superfici. Così, l'applicazione del presente protocollo CLEM è stato applicato con successo per studiare l'effetto di un composto antivirale contro HCV15 o visualizzare le riorganizzazioni di membrana indotte dalle proteine non strutturali di norovirus19. Un altro problema che può limitare le prestazioni di questo metodo è l'assenza di un dispositivo commerciale di FS. In questo caso, sistemi di FS in casa base possono essere utilizzati invece. Anche se i dispositivi automatici di FS potrebbero ridurre la gestione degli incidenti, dispositivi fatti in casa vengono utilizzati con successo per esempio a laboratori di Paul Walther e30 di Kent McDonald .
Per quanto riguarda la fissazione chimica, il protocollo descritto qui garantisce una conservazione ottimale delle strutture intracellulari20. Pertanto, nel caso in cui i suddetti dispositivi HPF e FS sono disponibili, vetrificanti le celle di interesse sarebbe comodo.
Futuro delle alternative a questo approccio di CLEM includono la possibilità di utilizzare questo metodo non solo di acquisire informazioni 2D a livello ultrastrutturale, ma anche di acquisire informazioni 3D sull'architettura della membrana e dell'organello alterazioni causate da virus. I metodi di 3D-EM, compreso tomografia elettronica (ET) e microscopia analisi del fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) (ampiamente descritta in29), potrebbero essere applicati anche alle cellule che sono state preparate seguendo questa corrente protocollo21, 31. Inoltre, informazioni 3D potrebbero essere ottenute anche a livello di LM, quando si utilizza un microscopio confocale, che permette l'acquisizione di z-stack. Infatti, questa opzione è altamente raccomandata quando una correlazione precisa tra DataSet LM ed EM è desiderato (Vedi ad esempio17). Le informazioni incluse negli stack di z 3D aiuta a migliorare la correlazione con le immagini TEM 2D. Così, in un tale scenario, il miglior montaggio immagini LM ed EM possa essere selezionato e poi sottoposti ad uno dei software disponibili, come il plugin di CE-CLEM di ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 o il plugin Landmark corrispondenze di correlazione Immagine di J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), con conseguente generazione di LM-EM immagini sovrapposte.
Quando l'informazione temporale è necessaria per comprendere la cinetica di un certo evento, time-lapse imaging consente di monitorare dinamiche delle cellule viventi in combinazione con EM. Durante l'evento di interesse, le cellule sono risolto immediatamente, generando una "istantanea bloccata" che possa essere successivamente analizzata con EM, fornendo informazioni dettagliate ultrastrutturali su quel particolare momento al momento dell'immobilizzazione. Al fine di ottenere quella "istantanea bloccata", dopo l'osservazione in tempo reale, le cellule possono essere chimicamente fisso33 o cryo-immobilizzata6. Poiché molti processi cellulari accadere più velocemente rispetto ai processi di diffusione di fissazione chimica, se possibile, congelamento ultra-rapido deve essere eseguita. Tuttavia, è importante tener conto che le macchine di HPF differiscono nella loro effettiva risoluzione34.
Inoltre, anche se questo protocollo è stato progettato per l'incorporamento delle cellule in una resina epossidica, le cellule possono essere anche incorporate in resine a bassa viscosità, come Lowicryls, LR bianco o oro LR. L'uso di questi mezzi incorporamento consente di preservare l'antigenicità35,36, come pure la fluorescenza37,38 e, pertanto, sono usati principalmente per Post-embedding su sezione immunolabeling39 , 40 e sulla sezione CLEM41,42,43,44, dove la LM è fatto dopo l'incorporamento. Entrambi gli approcci (immuno-EM e sulla sezione CLEM) devono essere fondamentali per quegli esperimenti in cui strutture non caratteristici si trovano facilmente via TEM e/o come controllo contro miscorrelation tra LM ed EM segnali. Allo stesso modo, etichettatura con gli anticorpi che possono essere visualizzati da entrambe modalità di imaging (LM ed EM) può essere effettuata45 al fine, ad esempio, identificare cellule transfected in LM (pre-embedding fase) ed ottenere una localizzazione molto più accurata della Segnale GFP via relativa etichettatura specifica di immuno-EM (fase post-embedding). Si deve tener conto, tuttavia, quel permeabilizzazione è condotta prima LM per consentire l'accesso degli anticorpi allo spazio intracellulare, che potrebbe comportare una sub-ottima conservazione dell'architettura delle cellule a livello di EM. Interessante, questo protocollo è anche adatto per esperimenti di multi-colore che può essere raggiunto con l'uso di altri tag fluorescente, diverso da GFP (come illustrato di seguito). In conclusione, ci sono molte possibilità putativo di adattare questo protocollo, il LM e/o sui lati EM, a seconda delle domande che vengono affrontate. Per una descrizione completa di altri protocolli alternativi si rinvia a5,46. Indipendentemente da come vengono combinate le modalità di microscopia, insieme il risultato è un guadagno di informazioni, che ci permette di capire meglio come i virus e le loro proteine interagiscono con i loro ospiti nella vita reale.
Il punto più critico all'interno di questo metodo è la raccolta di sezioni di serie dalle cellule di interesse. Come evidenziato nella sezione risultati rappresentativi, ciò richiede personale esperto, come pure un sacco di pazienza. Cosa importante, questo passaggio è essenziale per trovare le celle indietro a livello di EM per due motivi. In primo luogo, in questa sorta di protocollo di CLEM utilizzando pre-embedding LM, le coordinate sono visibili solo a livello di LM e sul viso di blocco di resina dopo l'incorporamento. Tuttavia, essi non sarà visibile sulle sezioni di TEM. Pertanto, rifilatura mirato sul fronte di blocco verso il basso per le regioni di interesse (ROI) deve essere compiuta con attenzione con una lama di rasoio per assicurare che le sezioni che vengono successivamente ottenute contengono le cellule che esprimono un dato FP. In secondo luogo, la "scansione" diverse sezioni è necessaria trovare la migliore sovrapposizione tra la LM e le acquisizioni di EM. Contrariamente ai metodi dove LM viene eseguita nella fase post-embedding, in questo caso la sovrapposizione di LM-EM non è così precisa. La precisione di sovrapposizione basso è a causa di differenze nella risoluzione assiale LM ed EM, ritiro durante l'elaborazione del campione di EM e la compressione durante il sezionamento42. Tuttavia, i metodi di monitoraggio efficiente, come l'uso di punti di riferimento, aiutano a trovare le cellule indietro. Questo include la posizione di una cella a altra, così come la forma delle cellule e del loro nucleo. A questo proposito, come spiegato nel protocollo, DIC immagini forniscono informazioni "anatomiche" delle cellule che sono fondamentali per migliorare la correlazione. In alternativa, i nuclei o altri organelli cellulari ben riconoscibile (ad esempio mitocondri o lipidica goccioline) possono essere macchiato prima LM e utilizzati come punti di riferimento.
Infine, è degno di menzione che sebbene questo manoscritto è incentrato sull'uso di questa tecnica per studi di virologia, la portata di questo disegno sperimentale può essere ampliata per affrontare questioni biologiche più generali.

L'idea di combinare due modalità di microscopia per ottenere una migliore immagine di un determinato processo biologico è piuttosto vecchio. Così, il primo studio sui virus usando "correlativa microscopia" è stato pubblicato nel 1960 come due pubblicazioni distinte1,2. In quello studio, gli autori hanno analizzato i cambiamenti nella morfologia del nucleo indotta da adenovirus mediante due tecniche di microscopia. Nella prima pubblicazione, osservazioni di microscopia elettronica (EM) che descrive i dettagli morfologici connessi con l'infezione dell'adenovirus sono stati segnalati1. In una seconda pubblicazione, le diverse strutture osservate da EM sono state correlate con immagini di microscopia (LM) di pattern di colorazione istochimica, per definire la natura delle strutture precedentemente osservato da EM2.
In questi primi studi, tuttavia, le loro osservazioni sono state eseguite utilizzando differenti cellule infettate preparate come esperimenti indipendenti. La "correlazione" era, infatti, inteso come la combinazione di informazioni provenienti da due modalità di imaging per capire un certo fenomeno, confrontando tutti i reperti che sono stati ottenuti con dosaggi diversi al fine di comprendere un dato biologico processo.
Al giorno d'oggi, la microscopia correlativa di termine, noto anche come correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM), viene applicata a un numero crescente di metodi (rivisto in riferimenti3,4,5), con la comunanza che sia tecniche di imaging (LM ed EM) vengono effettuate sullo stesso campione. La combinazione di entrambi i metodi risulta, quindi, in un'analisi multi-modale, multi-scala e multi-dimensionale di quel campione3. I vantaggi sono che LM può fornire un'ampia panoramica di molte cellule diverse, che consentano l'identificazione di sottopopolazioni di cellule esprimenti una proteina o le proteine di interesse all'interno di una popolazione eterogenea delle cellule. EM supera il limite di risoluzione di LM, fornendo un'immagine ad alta risoluzione di un particolare evento intracellulare. Inoltre, EM consente la visualizzazione del contesto subcellulare non fluorescenti, compresi tutti gli organelli membrana associato, grandi complessi macromolecolari (ad es., ribosomi, centrioli, ecc.) ed elementi del citoscheletro, quindi fornendo ulteriori informazioni spaziali, il cosiddetto "spazio di riferimento"6e dare un contesto allo spot fluorescente rilevati da LM.
Negli ultimi anni, CLEM è diventato un potente strumento non solo per cella biologi5, ma anche per virologi (rivisto in riferimento7) disposti a comprendere le interazioni virus-cellula complesse che portano ad una propagazione di virus di successo. Così, come virus modificare le membrane cellulari e organelli a proprio vantaggio la comprensione è essenziale per sviluppare farmaci antivirali per sradicare il virus patogeni.
Qui, un metodo di CLEM è descritto che permette la rilevazione di LM delle cellule che esprimono proteine virali fuse ad una proteina fluorescente (FP). Queste cellule vengono successivamente cryo-immobilizzata e ulteriormente preparato per l'analisi ultrastrutturale tramite microscopia elettronica di trasmissione (TEM) per acquisire nuove conoscenze in come l'espressione di queste proteine ridisporre le membrane intracellulari (Figura 1). CLEM è stato eseguito con cellule chimicamente fissate nella maggior parte degli studi virologia pubblicati in data8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Questo è principalmente dovuto alla necessità di inattivare materiale infettivo per motivi di sicurezza biologica in biosicurezza livello-2 e -3 (BSL-2 e BSL-3) laboratori, dove cryo-immobilizzazione delle cellule non è solitamente possibile. Per quelle domande che richiedono la conservazione ottimale delle membrane cellulari, vetrificazione tramite alta pressione congelamento (HPF) è, tuttavia, altamente consigliata20. In questi casi, può essere applicato il protocollo di CLEM descritto qui. È interessante notare che, soprattutto quando si lavora con campioni infetti, HPF può essere effettuato su campioni che sono stati precedentemente inattivati chimicamente, ad esempio nei laboratori BSL-2 e BSL-3. La combinazione di fissazione chimica seguita da HPF è una possibilità di profitto almeno parzialmente i vantaggi della crioconservazione metodi21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'analisi delle cellule via CLEM. Cellule che crescono su dischi zaffiro fantasia in primo luogo vengono analizzate da LM per localizzare le cellule che esprimono FPs prima della loro trasformazione per EM. Una volta individuato, cellule immediatamente corretti da HPF e FS per essere successivamente incorporato in resina. Al momento di polimerizzazione della resina, il supporto dove crescevano le cellule (= dischi zaffiro) devono essere rimossi dal blocco di resina. Il blocco contenente le cellule incorporate viene tagliato un piccolo trapezio da cui vengono sezionate le celle rimanenti, esprimendo FPs, con un coltello di diamante. Sezioni ultrasottili sono raccolti sulle griglie di slot e ulteriormente esaminati da TEM per ottenere informazioni ultrastrutturali di queste cellule. Questa figura è adattata e modificata con il permesso di riferimento29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

Grazie alla sua alta risoluzione, la microscopia elettronica (EM) è uno strumento indispensabile per virologi. Tuttavia, una delle principali difficoltà quando si analizzano le cellule transfettate o infettate da virus tramite EM sono la minor efficienza di infezione o trasfezione, ostacolando l'esame di queste cellule. Per superare questa difficoltà, microscopia (LM) può essere eseguita prima per allocare la sottopopolazione delle cellule trasfettate o infetti. Così, approfittando dell'uso di proteine fluorescenti (FPs) fuso a proteine virali, LM è qui utilizzato per registrare le posizioni delle cellule "trasfettate con positivo", esprimendo un FP e che cresce su un supporto con un modello alfanumerico. Successivamente, le cellule sono ulteriormente trattate per EM tramite alta pressione congelamento (HPF), congelare sostituzione (FS) e l'incorporamento di resina. Il passo di congelamento ultrarapido garantisce membrana eccellente conservazione delle celle selezionate che possono poi essere analizzati a livello ultrastrutturale di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Qui, viene fornito un flusso di lavoro luce correlativa passo dopo passo la microscopia elettronica (CLEM), che descrive la preparazione del campione, imaging e correlazione in dettaglio. Il disegno sperimentale può essere anche applicato per risolvere molte questioni di biologia delle cellule.

Utilizzando la procedura presentata qui (Figura 1), Huh7-Lunet cellule che esprimono stabilmente la T7 RNA polimerasi sono state seminate su dischi di zaffiri fantasia e successivamente transfected con un plasmide esprimente due domini del virus dell'epatite C (HCV) non strutturali della proteina NS5A, taggati con GFP (GFP-D1-pTM_AH) (Figura 4). Il giorno seguente, i dischi di zaffiro fantasia, dove le cellule crescevano, erano tolto i piatti di cultura cellulare ed imaged per mezzo di LM (Figura 4, Figura 2). Quelle cellule che esprimono la AH-D1-GFP sono stati identificati dalla presenza di fluorescenza verde nel citosol e registrati per salvare le loro posizioni all'interno del modello di coordinata dei dischi zaffiro (figure 5A, 5B). Immediatamente dopo il loro esame di LM, i dischi in zaffiro contenente le celle di interesse sono stati assemblati tra due elementi portanti di alluminio (Figura 3) e sottoposti a cryo-immobilizzazione di HPF. Le cellule sono state poi congelare sostituito e successivamente incorporati in resina epossidica.
Dopo la rimozione dei dischi zaffiro dai blocchi di resina polimerizzata, l'impronta del modello alfanumerico era visibile sulla faccia del blocco, che ha permesso di recuperare le aree dove si trovavano le celle di interesse. Il resto del blocco di resina è stato tagliato via per generare un piccolo trapezio che harboring le celle di interesse. Sezioni ultrasottili serie sono sono ottenute da questo trapezio, raccolti sulle griglie di EM slot e ulteriormente analizzate da TEM (Figura 5C). Nota che ottenere manualmente seriale sezioni consecutive anche se fattibile28 è laborioso e richiede personale ben addestrato e qualificato. È anche importante che le cellule hanno un basso confluency quando sottoposti a questo protocollo di CLEM (Figura 5A) al fine di garantire un rapido riconoscimento della stessa cella precedentemente identificato da LM. In caso contrario, avendo più alto confluency di cella potrebbe drammaticamente rallentare il successo individuazione delle cellule a livello di EM.
Analisi TEM di diverse sezioni ultrasottili della cella di interesse (figure 5, 5E), esprimendo l'AH-D1-GFP, ha rivelato la presenza nel suo spazio intracellulare di grandi accumulazioni di vescicole della morfologia variabile delimitato dalla che circonda il cytosol da un singolo strato lipidico (Figura 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figura 4 : Rappresentazione schematica del flusso di lavoro seguito per eseguire l'esempio di CLEM raffigurato Figura 5 . Huh7-Lunet cellule che esprimono stabilmente la T7 RNA polimerasi transfected con un plasmide DNA codifica l'elica amphipathic (AH) e il dominio 1 (D1) di proteina NS5A HCV, etichetta al suo C-terminale con GFP (pTM_AH-D1-GFP). L'espressione di questa parte della proteina NS5A è controllata trascrizionalmente da un promotore T7 (T7 Pm) e ribosomi da un elemento di IRES (luogo dell'entrata interna ribosoma) virus (EMCV) dell'encefalomiocardite, indicato da una struttura secondaria. Cellule di ventiquattro h post-transfezione (24 hpt) crescono modellato dischi in zaffiro ed esprimendo la AH-D1-GFP sono stati rilevati da LM e immediatamente sottoposti a HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figura 5 : Esempio di una routine di CLEM. (A) Huh7-Lunet cellule che esprimono stabilmente la polimerasi T7 analizzata da microscopia di fluorescenza per allocare cellule GFP-positive coltivate su dischi zaffiro fantasia, 24 ore dopo la trasfezione con il plasmide pTM_AH-D1-GFP. Immagine di ingrandimento superiore (B) di una singola cella selezionata all'interno del rettangolo tratteggiato bianco per essere analizzati da CLEM. (C) immagine TEM di una sezione ultrasottile della stessa cella dopo HPF, FS e l'incorporamento di resina. (D) rappresentazione schematica delle sezioni ultrasottili di serie 70-nm su una griglia di slot EM contenente la cella di interesse. (E) sulla sinistra: panoramiche TEM delle due sezioni della cellula di interesse. A destra: immagini TEM ad alto ingrandimento delle zone intracellulare selezionate in rettangoli gialli a sinistra, svelando un numero elevato di vescicole delimitate dal cytosol tramite una singola membrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

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