Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Vi er veldig takknemlig for ansatte i den elektronmikroskop Core fasiliteter (EMCF) på EMBL (Heidelberg) og Universitetet i Heidelberg. Vi også gjerne takke Ulrike Herian, Stephanie Kallis og Andrea Hellwig (Universitetet i Heidelberg), samt Eberhardt Schmidt og Renate Kunz (University Ulm) for ekspert teknisk assistanse. Av R.B. og hans team (U.H. og I.R.-B.) ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 og TRR83, TP13.

1. utarbeidelse av mønstret Sapphire plater for cellekultur
<ol><li>Overfør mønstret safir skiven (se Tabell for materiale), en alfanumerisk mønster risset inn på en av sine overflater, inn i et 15 mL konisk sentrifugering rør. Merk: Alternativt konvensjonelle 0.05 mm tykk safir plater uten alfanumeriske mønster kan brukes som en referanse mønster er laget av karbon belegg dem med et finder rutenett på toppen. Til dette målet, burde de være renset med etanol før karbon mønsteret brukes.</li>
	<li>Vaske dem grundig med etanol. Spre dem ut i en Petriskål med filter papir og la dem tørke. Plass dem på et glass lysbilde separat fra hverandre ved hjelp av slanke lange pinsett.</li>
	<li>Sjekk med en invertert mikroskopet (4 X forstørrelse) om mønsteret av koordinater er lesbar på hver safir plate. Merk: Hvis dette ikke er tilfelle, vende safir plater ved hjelp av pinsett.</li>
	<li>Lagre safir platene i en Petriskål. Merk: Protokollen kan pauses her.</li>
</ol>2. celle kultur med mønstret safir plater
<ol><li>Sterilisere mønstret safir platene med en ultrafiolett (UV) crosslinker i 5 minutter.</li>
	<li>Ta safir platene til celle kultur biosikkerhet kabinett. Sterilisere lang pinsett med etanol i biosikkerhet kabinett.</li>
	<li>Legg halvparten av celle kultur medium (se Tabell of Materials) til en celle kultur parabol. Overføre safir platene nøye med lang pinsett i celle kultur parabol.</li>
	<li>Frø 1 x 105 Huh7-Lunet celler, stabilt uttrykke T7 utvalg resuspended i andre halvdel av celle kultur medium, til kultur parabolen. Merk: Beregne antall celler å være seeded slik at på endepunktet for eksperimentet celle confluency skal ikke over 20-30%. Høyt tetthet vil hindre flytting av cellene ved senere stadier av EM. Over-confluency kan videre føre brøkdel av celler fra safir platene.</li>
	<li>Kontroller at safir platene forblir nederst på kultur parabol og at alfanumeriske koordinatene er fortsatt leses med invertert mikroskopet. Merk: Hvis platene flyter i celle kultur medium, bruke lang pinsett å presse platene nederst og til slutt å snu dem tilbake til riktig retning.</li>
	<li>Transfect cellene dagen som tidligere rapportert i referanser21,23 etter transfection agent instruksjonene fra produsenten.</li>
</ol>3. LM Imaging celleområde vokser på mønstret safir plater
<ol><li>Overføre safir platene på endepunktet for eksperimentet til en tenkelig metallplaten som inneholder 30-50 µL / plassering for pH indikator-fri medium å redusere uspesifikke bakgrunn fluorescens. Merk: Metallplaten beskrevet her (figur 2) er blitt beregnet ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL) verkstedet. I fravær av denne platen eller en lignende en, kan glass bunn celle kultur retter også brukes i stedet for LM. Det er viktig å endre normal celle kultur medium for medium uten pH indikator. Merk også at lange eksponeringstider bør unngås fordi de kan forårsake photobleaching, fører til reaktive oksygen arter (ROS) akkumulering og fysiologiske skade av celler24,25.</li>
	<li>Bilde cellene under et omvendt widefield fluorescens mikroskop. Merk: Når du bruker en grønn fluorescerende protein (GFP)-merket protein, som vist i representant resultatene, 450-490 nm og 500-550 nm eksitasjon og utslipp filtre, henholdsvis skal brukes.</li>
	<li>Hent først en lav forstørrelse bilde (10-20 X) i cellene tildele celler uttrykke FPs. post koordinatene til mønstrede safir platene hvor cellene rundt finnes ved hjelp av differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi. Merk: Søm flere områder kan hjelpe for å ha en bedre oversikt over plasseringen av cellen/cellene rundt. Merk også at fase kontrast mikroskopi kan eventuelt brukes her.</li>
	<li>Hente forstørring (fluorescens og DIC) bilder (63-100 X, oljeneddyp mål) i samme celle/cellene bedre skjelne den subcellular lokaliseringen av protein av interesse innen intracellulær. Merk: DIC bilder gi kontekstavhengig informasjon. Denne informasjonen er ofte kritiske å korrelere LM bilder med EM micrographs senere fordi siste korrelasjonen er mer nøyaktig med "anatomiske" landemerker i cellen. Som noen safir plater kan bryte under cryo-immobilisering, anbefales det å forberede triplicates per betingelse. Videre løsne noen celler fra platene under HPF og de påfølgende trinnene i denne protokollen, mens ultrastructure av andre celler kan inneholde gjenstander av frysing skade. Derfor bør minst to områder av plater avbildes via LM å sikre at til slutt vil det være nok celler som skal analyseres. Viktigere, skal disse to områdene være på motsatte sider av platen. På denne måten harpiks blokken der cellene er innebygget kan bli kuttet i to halvdeler og deler av disse områdene kan oppnås.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig2.jpg"> Figur 2 : Skjemaet for LM avbilding av cellene vokser på mønstret safir plater. (A) safir platene overføres hjelp fine pinsett til en tenkelig plate. (ABC) Denne platen er spesielt utviklet på EMBL workshop i Heidelberg å passe inn i lys mikroskopet, der safir platene kan avbildes med celle kultur medium uten pH indikator. Det består av et metall lysbilde, 75 mm x 25 mm x 1 mm, med fire-fem hull valset inn i det med en 3 mm borekronen utsnittet av safir plater. I tillegg var små spor valset på hver side av hullene i 90° vinkel. Disse hullene gjør det enklere å få tilgang plater med tang når manipulere dem. For å gi optimale imaging forhold var glass coverslips nr 0 (0.085 til 0,13 mm tykk) limt under hullene med UV lim og plassert under UV-lys å stivne. (D) forstørring bilde av mønstret safir platen viser de alfanumeriske koordinatene som er gravert på overflaten. Mønstret safir platene er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
4. Cryo-immobilisering av cellene vokser på mønstret Sapphire plater via HPF
<ol><li>Plasser de "A" og "B" aluminium stativer for HPF (se Tabell for materiale) i en Petriskål med filter papir fuktet med 1-hexadecene. Fordype mønstret safir platene som inneholder cellene i en Petriskål med 1-hexadecene. Merk: Flytte plater litt å regne celle kultur medium.</li>
	<li>Samle safir platene mellom en "A" og "B" aluminium bærer i HPF holderen som følger (Figur 3B). På bunnen, kan du plassere en "B" bærer med flate siden vendt oppover. Plass safir plater på denne flate siden med celler vendt oppover. Legge til en "A" carrier med 0,1 mm dybden mot cellene. Merk: Fordi mønstret safir platene er tykkere enn konvensjonelle safir plater, kommersielt tilgjengelig "A" bærer (utviklet for bruk med ikke-mønstret 0.05 mm safir plater) hadde kuttes til 0.05 mm på denne 0.2 mm dybde siden på EMBL workshop for å passe inn i HPF holderen (Figur 3A). Til dette målet settes "A" bærer inn i slutten av et metall rør slik at siden 0.2 mm er eksponert og forblir fortsatt mens kutte det ned. Kuttet ned siden er og sanded slik at det er flat. Alternativt, en spesiell aluminium transportør kan brukes på mønstret safir platen (kommersielt tilgjengelig, se Tabellen for materiale), som i dette tilfellet HPF "sandwich" består bare av safir platen og denne operatør.</li>
	<li>Lukk innehaver av HPF maskinen og fryse cellene. Merk: Denne protokollen er spesifikke for en bestemt HPF maskin. Andre HPF maskiner kunne alternativt brukt6,26. I alle fall vær klar over eksistensen av ny generasjon maskiner fra leverandører. Advarsel: Bruk vernebriller og høre beskyttelse hodetelefonen.</li>
	<li>
Plass den frosne "sandwich" i en polystyren boks med flytende nitrogen for midlertidig lagring. FORSIKTIG: Bruk beskyttelsesbriller og komme i kontakt med de lokale Trygghets informeres om potensielle farer ved håndtering av flytende nitrogen.<ol>
<li>For å unngå forvirring, plasser hver "sandwich" i en egen 0,5 mL microcentrifuge tube (inne boksen polystyren) merket med et tall. Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis fryse substitusjon (FS) ikke kan utføres umiddelbart, prøvene er lagret i cryo-rør (med en hullet øverst) i boksene, som holdes i en rack på en kryogene flytende nitrogen dewar (se Tabell for materiale). Denne flytende nitrogen-beholderen finnes i et rom med oksygen gass sensorer, unngå kvelning i tilfelle en oksygenmangel. Advarsel: Alle fremgangsmåtene nedenfor (trinn 5 og 6) må utføres i en biosafety kabinett. Videre er de fleste av de anvendte reagensene farlig. Før du bruker dem, er det obligatorisk å lese nøye i HMS-Datablad produsentene, samt stille sikkerhet offiserer om lokale regler å sikre trygg håndtering. For avhender disse brukte materialer og riktig bruk av utstyret beskrevet nedenfor, er det også nødvendig å konsultere lokale instituttets helse og sikkerhetsprosedyrer.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig3.jpg"> Figur 3 : Skjema av mønstret sapphire plater mellom to aluminium stativer for HPF. (A) visninger av en konvensjonell "A" bærer, som har kuttes på dypere siden fra 0.2 mm til 0.05 mm. (B) 0,16 mm tykk safir platen med alfanumeriske mønster etset på overflaten er samlet inn to aluminium stativer for HPF , som følger: safir platen er plassert på den flate siden av en "B" cellene vendt oppover. En hakket "A" carrier med 0,1 mm dybden mot cellene er plassert øverst til nær "HPF sandwich". Aluminium bærere og mønstret safir platene er kommersielt tilgjengelig (se Tabell for materiale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
5. FS Cryo-fast celler
<ol><li>Fylle maskinen FS (se Tabell for materiale) med flytende nitrogen. Still inntemperaturen-90 ° c og vente til maskinen når denne temperaturen.</li>
	<li>Forberede FS mediet som inneholder 0,2% osmium tetroxide (OsO4) (v/v), 0,1% uranyl acetate (UA) (w/v) på glass-destillert aceton mens FS maskinen er kjøles ned. Merk: For å forberede, (for eksempel) 12 mL FS medium, bland 600 µL av 4% OsO4med 0.012 g til Filmselskapet i et lite glass container. Oppløse denne blandingen i en ultralydbad enhet for 5 min. legge 11.4 mL av glass-destillert aceton med en pipette, og bland godt.</li>
	<li>Fylle opp 1,5 mL microcentrifuge rør med 200-500 µL av FS medium, stenger lokket og overføre dem til FS maskinen. Vente 10 min for FS mellomstore avkjølt.</li>
	<li>Transfer frosne "smørbrød" inneholder safir plater med celler i flytende nitrogen ved hjelp av avkjølt lang pinsett til rør som inneholder FS medium. Advarsel: Bruk cryo-beskyttende hansker og beskyttelsesbriller. Merk: HPF "smørbrød" kan demonteres spontant under deres håndtering. I dette tilfellet, kontroller at frosne safirer platene er overført til microcentrifuge rør. Aluminium bærere kan kastes.</li>
	<li>Kjøre FS slik til de neste dag27: fra-90 ° C-80 ° c 8 h; fra-80 ° C-50 ° c 8 h; fra-50 ° C til-20 ° C for 2t; fra 20 ° C 0 ° c for 2T.</li>
</ol>6. harpiks innebygging av fryse erstattet prøver
Advarsel: Alle fremgangsmåtene nedenfor må utføres i en biosafety kabinett. Videre er de fleste av de anvendte reagensene farlig. Før du bruker dem, er det obligatorisk å lese nøye i HMS-Datablad produsentene, samt stille sikkerhet offiserer om lokale regler å sikre trygg håndtering. For avhender disse brukte materialer og riktig bruk av utstyret beskrevet nedenfor, er det også nødvendig å konsultere lokale instituttets helse og sikkerhetsprosedyrer.
<ol><li>Ta ut den erstattede prøver fra FS maskinen og plassere dem på is 20 min.</li>
	<li>Holde prøvene ved romtemperatur for 20 min og vaske dem grundig (3 ganger, 10 min hver) med glass-destillert aceton. Kast aluminium operatører med lang pinsett hvis de er fortsatt i microcentrifuge rør etter FS.</li>
	<li>Infiltrere cellene (på gjenværende safir plater) i en fire-trinns epoxy harpiks serie med 1t incubations i 25%, 50% og 75% harpiks i glass-destillert aceton, etterfulgt av natten inkubasjon med 100% harpiks. Utveksle 100% harpiks dagen 1t.</li>
	<li>Forsiktig plassere safir platene i gjennomflytsenhet ringer montert i reagens badekar fylt med 100% harpiks. Disse ringene brukes som polymerisasjon former for 10 safir plater. Merk: Safir plater må være fullstendig skjøvet til bunnen med koordinater vendt oppover i en lesbar måte. Dette kan kontrolleres med hjelp av en kikkert knyttet til en røyk extractor. Alternativt kan en kikkert inne en biosafety regjering brukes i stedet. Viktigst, det er tall (1-10) inngravert på bunnen av reagensene som bidrar til å identifisere prøvene.  I tillegg til identifikasjon av prøvene kunne en papir-kode inkluderes i harpiks blokken.</li>
	<li>Danner eksemplene i ovnen på 60 ° C i 48 timer.</li>
</ol>7. fjerning av mønstret safir plater fra Polymerized harpiks blokker
<ol><li>Fjerne hard harpiks blokker som inneholder cellene fra ovnen. Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis ikke, la blokker avkjøles til romtemperatur før klippe dem.</li>
	<li>Kuttet innebygging formene med et barberblad tilgang til harpiks blokkene. Fjerne sylindriske harpiks blokker ved hjelp av pinsett. Merk: Hvis en papir-kode ikke er tatt med i harpiks blokkere før polymerisasjon, antallet blokker med en permanent penn og lagre dem i 1,5 mL microcentrifuge rør. Protokollen kan pauses her.</li>
	<li>Senk spissen av harpiks blokken med safir platen i en polystyren med flytende nitrogen til den stopper "bobler". Deretter fordype spissen av harpiks blokken i kokende H2O.</li>
	<li>Gjenta de to trinnene så mange ganger som nødvendig til safir platen faller av harpiks blokken. Advarsel: Bruk beskyttelsesbriller og cryo-beskyttende hansker. Merk: Hvis dette ikke virker, bruk et barberblad fjerne litt av polymerized harpiks rundt platene før du prøver igjen. Protokollen kan pauses her.</li>
</ol>8. målrettet Trimming og supertynn snitting for TEM
<ol><li>Identifisere området på harpiks blokk ansiktet hvor cellene rundt er tilstede ved å blokkere ansiktet med kikkerter av en ultramicrotome. Merk: Negative forlaget for koordinere mønster fra mønstret safir platene beholdes i blokk ansiktet. Dette gjør identifikasjon av området der cellene rundt finnes for målrettet trimmer. LM bildene må være vendt loddrett for å lette funn av samme posisjon i blokk ansiktet.</li>
	<li>Trimme den innebygde celle monolayer inneholder cellen/cellene av interesse for en liten flat pyramide med formen på en trapes (~ 200 µm × 250 µm gjennomsnittlig størrelse) med en ren barberblad.</li>
	<li>Få 70-nm ultrathin deler av de innebygde cellene med 35° diamant kniv.</li>
	<li>Plass delene på EM spor rutenett hjelp ultra-fine pinsett. Merk:: bruk av mesh rister bør unngås fordi delene kan bli maskert av rutenettet barer.</li>
	<li>Lagre rutenettene i et rutenett-boksen. Merk: Protokollen kan pauses her.</li>
</ol>9. TEM analyse av Ultrathin deler
<ol><li>Plass spor rutenettet i innehaveren av elektronmikroskop overføring. Kjøpe lav forstørrelse (oversikt) bilder, der hele cellen profilen til cellen rundt er synlig. Merk:: cell/cellene rundt finnes tilbake ved å bruke celle profiler og plasseringen av cellene til hverandre som referanser, sammenligne visningene DIC kjøpt før av LM.</li>
	<li>Hente forstørring bilder av cellen/cellene av interesse, å prøve og finne, på ultrastructural nivå, funksjoner som tilsvarer fluorescerende signalene observert tidligere av LM. Merk: Montasje bilder fås ved høy forstørrelse å ha en oversikt med høy oppløsning av cellen/cellene rundt. Videre er det ofte nødvendig å skaffe bilder av samme celle i etterfølgende føljetong avsnittene å rekonstruere cellen i 3D før sammenligne fluorescens bildene.</li>
</ol>

Forfatterne ikke avsløre.

CLEM metodikken presentert her for å studere virkningen av en viral protein uttrykk i celle membraner har blitt brukt før for å belyse HCV replikering-assosiert strukturer, hovedsakelig dobbel membran blemmer (DMVs)21, samt bestemme kritisk byggesteinene kreves til disse HCV-indusert strukturer23. Merk at i vårt første arbeid bruk av CLEM HCV replikering21, en litt modifisert versjon av protokollen beskrevet her ble brukt. At studien, konvensjonelle 0.05 mm tykk safir plater, uten alfanumeriske mønster, ble brukt som en referanse mønster ble opprettet av karbon belegg dem med et finder rutenett på toppen (se Tabell for materiale). Denne versjonen av gjeldende protokollen kan til slutt brukes, med fordelen at "A" bærer for HPF kan brukes direkte, uten behov for å kutte det ned som i Figur 3A. Alternativt, som nevnt i protokollen, tykkere "A" bærer kan brukes (se Tabell for materiale) med mønstret safir plater, uten behovet av en "B" operatør.
Interessant, kan denne protokollen brukes ikke bare å studere BSL-1 eksempler, slik som celler transfekterte med virale proteiner som beskrevet her og andre steder19,23, men også å studere virus-infiserte celler. Selv om arbeide med mennesker er vanligvis begrenset til BSL-2 og BSL-3 laboratorier, i enkelte land er det fortsatt mulig å utføre cryo-immobilisering under disse biosikkerhet forhold. I disse BSL-2 og BSL-3 laboratorier der vitrifikasjon ikke er mulig på grunn av lokale bestemmelser eller fraværet av en HPF maskin, kan virus-infiserte celler fortsatt tilberedes bruke denne metoden hvis kjemiske fiksering med aldehyder er utført på forhånd, nemlig før avreise BSL-2 eller BSL-3 fasiliteter. Videre må aldehyder bli slukket umiddelbart etter fiksering holde fluorescens, mens resten av protokollen er identisk med den som er beskrevet her. Denne teknikken kan anses overflødig fordi cellene er fast to ganger, kjemisk og via vitrifikasjon. Men fører denne dobbel fiksering protokollen faktisk til en mye bedre bevaring av HCV-indusert DMVs i forhold til DMVs i cellene utsatt for kjemiske fiksering alene21.
For ytterligere endringer og feilsøking leseren kalles notatene hele delen protokollen i dette manuskriptet. Disse notatene beskriver fallgruvene å unngå, samt alternativer å overvinne mulige problemer som kan oppstå når du utfører denne metoden.
Det viktigste forutsetning for å bruke denne teknikken er en HPF maskin. Når cryo-immobilizing cellene via HPF er ikke gjennomførbart (på grunn av en HPF maskin) eller ikke nødvendig (når membranen bevaring ikke trenger å være optimalt), celler kan kjemisk fast og senere forberedt og analyseres av EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Dette alternativet krever ikke bruk av safir plater, men celle kultur retter med gridded mønstre for flytting av celler eller cellen klynger. Hovedfordelen ved bruk av disse rettene er deres større diameter i forhold til safir plater, screening av større flater. Dermed har anvendelsen av denne CLEM protokollen vært anvendt studere effekten av en antiviral stoff mot HCV15 eller visualisere membran rearrangements indusert av nonstructural proteiner noroviruses19. En annen sak som kan begrense ytelsen til denne metoden er fraværet av en kommersiell FS-enhet. I dette tilfellet kan grunnleggende hjemmelaget FS systemer brukes i stedet. Selv om automatisk FS enheter kan redusere håndtering uhell, hjemmelagde enheter brukes med hell for eksempel på Kent McDonalds30 og Paul Walther labs.
Med hensyn til kjemiske fiksering sikrer protokollen beskrevet her en optimal bevaring av intracellulær strukturer20. Derfor, i tilfelle de nevnte HPF og FS enhetene er tilgjengelige, vitrifying cellene rundt vil bli foretrukket.
Fremtidige alternativer til denne CLEM tilnærmingen omfatter muligheten av benytter denne metoden ikke bare å kjøpe 2D informasjon på ultrastructural nivå, men også å få 3D-informasjon om arkitektur av membran og organelle endringer forårsaket av virus. 3D-EM metoder, inkludert elektron tomografi (ET) og fokusert ion bjelke-skanning elektronmikroskop (FIB-SEM) (grundig beskrevet i29), kan også brukes til celler som er utarbeidet etter denne gjeldende protokollen21, 31. I tillegg kan 3D-informasjon også hentes på LM nivå, når du bruker en AC confocal mikroskop, hvilke innrømmer oppkjøpet av z-stabler. Faktisk, anbefales dette valget når en presis sammenheng mellom LM og EM datasett er ønsket (se for eksempel17). Informasjonen som finnes i 3D z-stabler hjelpemidler for å forbedre sammenhengen med 2D TEM bilder. Dermed i et slikt scenario, kan best passer LM og EM bilder valgt og deretter utsatt for en av de korrelasjon programvare tilgjengelig, som EU-CLEM plugin ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 eller landemerke Correspondences plugg av Bildet J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), noe som resulterer i generasjon av overlappende LM-EM bilder.
Når timelige informasjon er nødvendig å forstå kinetics av en viss hendelse, kan tidsinnstilt bildebehandling brukes til å overvåke dynamikken i levende celler i kombinasjon med EM. Under arrangementet av interesse repareres celler umiddelbart generere en "frosset snapshot" som senere kan analyseres via EM, gir detaljert ultrastructural informasjon om det aktuelle øyeblikket ved immobilisering. For å få den "frosne snapshot", etter observasjon i sanntid, kan cellene kjemisk fast33 eller cryo-immobilisert6. Siden mange mobilnettet prosesser skje raskere enn diffusjon prosessene av kjemiske fiksering, hvis mulig, skal ultra rask frysing utføres. Det er imidlertid viktig å ta hensyn til at HPF maskiner varierer i sine effektiv oppløsning34.
Videre, selv om denne protokollen utviklet for innebygging av celler i en epoxy harpiks, celler kan også bygges i lav viskositet harpikser, som Lowicryls, LR hvit eller LR gull. Bruk av disse innebygging media kan beholde antigenicity35,36, samt fluorescens37,38 , og derfor brukes hovedsakelig for post innebygging på delen immunolabeling39 , 40 og på-seksjonen CLEM41,42,43,44, der LM er gjort etter innebygging. Begge tilnærminger (immuno-EM og på-seksjonen CLEM) må være avgjørende for disse eksperimentene som ikke-karakteristisk strukturer lett kan finnes via TEM og/eller som en kontroll mot miscorrelation mellom LM og EM signaler. Likeledes, merking med antistoffer som kan visualiseres både tenkelig modaliteter (LM og EM) kan utføres45 for å, for eksempel identifisere transfekterte celler i LM (pre embedding scenen) og oppnå et mye mer nøyaktig lokalisering av den GFP signal via sine spesifikke merking av immuno-EM (etter innebygging scenen). Det må tas i betraktning, men at permeabilization utføres før LM tillater tilgang av antistoffer til intracellulær plass, noe som kan resultere i en sub-optimal bevaring av cellen arkitekturen på EM nivå. Denne protokollen er interessant også godt egnet for multi-farge eksperimenter som kan oppnås med bruk av andre fluorescerende koder, enn GFP (som vist her). I konklusjonen, finnes det mange mulige muligheter til å tilpasse denne protokollen, både på LM og/eller på EM sidene, avhengig av spørsmål som tas. En omfattende beskrivelse av protokoller alternativ kalles leseren5,46. Uansett hvordan mikroskopi modaliteter kombineres, er sammen resultatet en gevinst for, tillater oss å forstå hvordan virus og deres proteiner sammen med deres verter i det virkelige liv.
Det mest kritiske trinnet i denne metoden er samlingen av føljetong inndelinger fra cellene rundt. Som fremhevet i delen representant resultater krever dette ekspert ansatte, samt mye tålmodighet. Viktigere, er dette trinnet viktig å finne celler tilbake på EM nivå av to grunner. Først i denne slags CLEM protokollen bruker pre innebygging LM, vises koordinatene bare på LM nivå og på harpiks blokk ansiktet etter innebygging. Men vises de ikke på delene av TEM. Derfor må målrettet trimmer i blokk ansiktet ned til områder av interesse (ROIs) gjøres nøye med et barberblad slik at delene som hentes senere inneholder celler som uttrykker gitt FP. Andre er "skanning" flere deler nødvendig å finne beste overlappingen mellom LM og EM oppkjøp. I motsetning til metoder der LM er utført på post innebygging scenen, er i dette tilfellet LM-EM overlegg ikke så nøyaktig. Lav overlegg nøyaktigheten skyldes forskjeller i aksial oppløsning mellom LM og EM, krymping under eksempel behandling av EM og komprimering under snitting42. Likevel bidra effektiv oppfølgingsmetoder, som bruk av landemerker, til å finne celler tilbake. Dette inkluderer plasseringen av en celle til en annen, så vel som formen på cellene og deres kjernen. I denne forbindelse, som forklart i protokollen, gir DIC bilder "anatomiske" informasjon av cellene som er avgjørende for å forbedre sammenhengen. Alternativt kjerner eller andre godt-gjenkjennelig celle organeller (for eksempel mitokondrier eller lipid dråper) kan være farget før LM og brukt som landemerker.
Til slutt, det er bemerkelsesverdig å nevne at selv om dette manuskriptet fokuserer på bruk av denne teknikken for virologi studier, omfanget av denne eksperimentell design kan utvides for å håndtere mer generelle biologiske spørsmål.

Ideen om å kombinere to mikroskopi modaliteter å få et bedre bilde av en bestemt biologisk prosess er ganske gammel. Dermed ble den første studien om viruser benytter "correlative mikroskopi" utgitt i 1960 som to separate publikasjoner1,2. I denne studien analyserte forfatterne endringene i morfologi av kjernen indusert av adenoviruses ved hjelp av to mikroskopi teknikker. I den første utgivelsen var elektronmikroskop (EM) observasjoner som beskriver morfologiske detaljene knyttet adenovirus infeksjon rapportert1. I andre publikasjoner, var ulike strukturer observert av EM korrelert med * lys (LM) bilder av histochemical flekker mønstre, definere hva slags strukturer tidligere observert av EM2.
I disse tidlige studiene, men ble observasjonene utført med forskjellige infiserte celler forberedt som uavhengige eksperimenter. "Sammenheng" var faktisk ment som kombinasjonen av informasjon fra to tenkelig modaliteter å forstå en viss fenomen, sammenligne alle resultatene som er anskaffet med ulike analyser for å forstå en gitt biologisk prosessen.
I dag brukes begrepet correlative mikroskopi, også kjent som correlative lys og elektronmikroskop (CLEM), på et økende antall metoder (omtalt i referanser3,4,5), med felles at både Bildeteknikker (LM og EM) utføres på samme prøven. Kombinasjonen av begge metodene gir, dermed en multimodal, multi-skala og flerdimensjonal analyse av at eksempel3. Fordelene er at LM kan gi en bred oversikt over mange ulike celler, slik at identifikasjon av cellen subpopulasjoner uttrykke et protein eller proteiner av interesse i en heterogen celle befolkningen. EM overvinner oppløsning grensen på LM, gir et høyere oppløsning bilde av en bestemt intracellulær hendelse. Videre gjør EM visualisering av ikke-fluorescerende subcellular sammenheng, inkludert alle membran-bundet organeller, store macromolecular komplekser (f.eks ribosomer, centrioles, etc.) og cellen cytoskjelett elementer, og dermed gir ekstra romlig informasjon, den såkalte "referanse plass"6, og gi kontekst til lysrør stedet oppdages av LM.
De siste årene, CLEM har blitt et kraftig verktøy ikke bare for celle biologer5, men også for virologists (omtalt i referanse7) villig til å forstå komplekse virus-celle samhandlingene som fører til en vellykket virus overføring. Dermed er forstå hvordan virus endre celle membraner og organelles til sin egen fordel avgjørende å utvikle antivirale midler for å utrydde patogene virus.
Her beskrives en CLEM metode som tillater påvisning av LM celler uttrykke virale proteiner smeltet til et fluorescerende protein (FP). Disse cellene er senere cryo-immobilisert og mer forberedt for ultrastructural analyse via overføring elektronmikroskop (TEM) å få ny innsikt i hvordan uttrykket av disse proteinene omorganisere intracellulær membraner (figur 1). CLEM er utført med kjemisk fast celler i de fleste virologi studier publisert dato8,9,10,11,12,13,14 ,,15,,16,,17,,18,,19. Dette er hovedsakelig på grunn av behovet for å inaktivere smittsomme materiale for biosikkerhet grunner i grad-2 og -3 (BSL-2 og BSL-3) laboratorier, hvor cryo-immobilisering av cellene ikke er vanligvis mulig. For spørsmål som krever en optimal bevaring cellemembraner vitrifikasjon via høytrykk frysing (HPF), men anbefales20. I disse tilfellene kan CLEM protokollen beskrevet her brukes. Interessant, spesielt når du arbeider med smittefarlige prøver, kan HPF utføre på eksempler som har vært tidligere kjemisk deaktivert, for eksempel i BSL-2 og BSL-3 laboratorier. Kombinasjonen av kjemiske fiksering etterfulgt av HPF er en mulighet til å tjene minst delvis fordelene cryo-bevaring metoder21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figur 1 : Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for analyse av celler via CLEM. Cellene vokser på mønstret safir plater analyseres først av LM å lokalisere celler uttrykke FPs før behandlingen for EM. Når funnet, repareres umiddelbart celler av HPF og FS bygges deretter i harpiks. Ved polymerisering av harpiks, støtte der celler vokste (= safir plater) må fjernes fra harpiks blokken. Blokken som inneholder de innebygde cellene beskjæres til en liten trapes som de gjenværende cellene, uttrykke FPs, er delt med diamant kniv. Supertynn deler er samlet på sporet rutenett og videre undersøkt av TEM å få ultrastructural informasjon til disse cellene. Dette tallet er tilpasset og endret med tillatelse fra referanse29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

På grunn av dens høy oppløsning er elektronmikroskop (EM) et uunnværlig verktøy for virologists. Men en av de største vanskelighetene når du analyserer virusinfiserte eller transfekterte celler via EM er lav effektiviteten av infeksjon eller hva, hindre undersøkelse av disse cellene. For å overkomme dette problemet, kan * lys (LM) utføres først for å tildele subpopulasjon av infisert eller transfekterte celler. Dermed dra nytte av fluorescerende proteiner (FPs) smeltet virale proteiner, LM brukes her til å registrere plasseringen av "positiv-transfekterte" cellene, uttrykke FP og vokser på en støtte med en alfanumerisk mønster. Deretter cellene behandles videre for EM høytrykk frysing (HPF), fryse substitusjon (AS) og harpiks innebygging. Det ultra rask frysing trinnet sikrer utmerket membran bevaring av de merkede cellene som kan deretter analyseres på ultrastructural nivå av overføring elektronmikroskop (TEM). Her, er en trinnvis correlative lys elektronmikroskop (CLEM) arbeidsflyt gitt, som beskriver eksempel forberedelse, bildebehandling og sammenheng i detalj. Eksperimentell design kan også brukes for å løse mange celle biologi spørsmål.

Bruke prosedyren presenteres her (figur 1), Huh7-Lunet celler uttrykke stabilt T7-RNA polymerase var seeded mønstret safirer plater og senere transfekterte med en plasmider uttrykke to domener av hepatitt C-viruset (HCV) nonstructural protein NS5A, merket med GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Figur 4). Dagen ble mønstret safir skiven, der cellene vokste, tatt ut av celle kultur retter og fotografert med LM (Figur 4, figur 2). Celler uttrykke AH-D1-GFP ble identifisert av tilstedeværelsen av grønne fluorescens i stoffer og registrert for å redde sine posisjoner innen koordinaten-mønsteret av safir plater (tall 5A, 5B). Umiddelbart etter deres LM undersøkelse, safir platene som inneholder cellene rundt var samlet mellom to aluminium bærere (Figur 3) og utsatt for cryo-immobilisering av HPF. Cellene ble deretter fryse substituerte og senere bygd inn i en epoxy harpiks.
Ved fjerning av safir plater fra polymerized harpiks blokkene var et avtrykk av alfanumerisk mønsteret synlig på blokk ansiktet, som henter områdene hvor cellene rundt lå. Resten av harpiks blokken var trimmet bort for å generere en liten trapes skjuler cellene rundt. Seriell ultrathin deler var Hentet fra denne trapes, samlet på EM spor rutenett og ytterligere analysert av TEM (figur 5C). Merk at innhenting manuelt føljetong etterfølgende avsnittene selv om mulig28 arbeids intense og krever veltrente og dyktige personell. Det er også viktig at på cellene har en lav confluency når utsatt for denne CLEM protokollen (figur 5et) garanterer en rask anerkjennelse av samme celle tidligere identifisert av LM. Ellers kan har høyere celle confluency dramatisk redusere hastigheten vellykket lokalisering av celler på EM nivå.
TEM analyse av flere ultrathin deler av cellen rundt (tall 5 d, 5E), uttrykker den AH-D1-GFP, avslørte tilstedeværelsen i sin intracellulær plass for store ansamlinger av blemmer av variabel morfologi atskilt fra den rundt stoffer ved en enkelt lipid bilayer (figur 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figur 4 : Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten fulgte utføre eksemplet CLEM avbildet i Figur 5 . Huh7-Lunet celler uttrykke stabilt T7-RNA polymerase ble transfekterte med en DNA plasmider koding amphipathic helix (AH) og domenet 1 (D1) HCV NS5A protein, merket på sin C-terminalen med GFP (pTM_AH-D1-GFP). Uttrykk for denne delen av NS5A protein kontrollert transcriptionally ved en T7 promoter (T7 Pm) og translationally et encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES (intern ribosom oppføring område) element, angitt av en sekundær struktur. Tjuefire h etter transfection (24 hpt) celler vokser på mønstret safir plater og uttrykke AH-D1-GFP ble oppdaget av LM og umiddelbart utsatt for HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figur 5 : Eksempel på en CLEM prosedyre. (A) Huh7-Lunet celler uttrykke stabilt T7 polymerase analysert av fluorescens mikroskopi tildele GFP-positive celler dyrket på mønstret safir plater, 24 timer etter hva med plasmider pTM_AH-D1-GFP. (B) , høyere bilde forstørrelse av en enkeltcelle valgt i hvite stiplede rektanglet som analyseres ved CLEM. (C) TEM bilde av en supertynn del av den samme cellen etter HPF, FS og harpiks innebygging. (D) skjematisk fremstilling av føljetong 70-nm ultrathin deler på et spor EM rutenett inneholder cellen rundt. (E) på venstre side: TEM oversikter over to inndelinger på cellen rundt. Til høyre: forstørring TEM bilder av intracellulær områdene valgt i gul rektangler til venstre, avslørende høyt antall blemmer atskilt fra stoffer via en enkelt membranen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Correlative lys elektronmikroskop (CLEM) for sporing og Imaging Viral Protein forbundet strukturer i Cryo-immobilisert celler

En correlative lys elektronmikroskop (CLEM) metode brukes bilde virus-indusert intracellulære strukturer via elektronmikroskop (EM) i cellene som er tidligere valgt av * lys (LM). LM og EM kombineres som en hybrid tenkelig tilnærming til å oppnå en integrert visning av virus-vert interaksjoner.

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Trykk Lasting og korrelative Noninvasive Imaging av Bone-periodontal ligament-tann fibrøs Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studerer Støkiometrien av epidermal vekstfaktor reseptor i intakte celler bruker korrelative Mikros

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Samsvarende lys- og elektronmikroskopi Bruke Quantum Dot Nanopartikler

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Lys arks fluorescens mikroskopi for studier av Murine hjertet

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedheft formasjon i celler ved hjelp av avansert spinner disken totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...