Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Мы очень благодарны сотрудникам электронной микроскопии зал Core (EMCF) в EMBL (Гейдельберг) и в Гейдельбергском университете. Мы также хотели бы поблагодарить Ulrike Herian, Стефани Kallis и Андреа Hellwig (Гейдельбергский университет), а также Эберхардт Шмидт и Ренате Kunz (Университета Ульм) для экспертной технической помощи. Работа р.б. и его команда (его и И.Р.-б.) было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 и TRR83, ТР13.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Клем методологии, представленные здесь для изучения воздействия вирусных белков на клеточные мембраны успешно использовался до прояснения ВГС репликации связанные структуры, главным образом двойная мембрана везикулы (DMV)21, а также определение критического строительные блоки, необходимые для формирования этих структур HCV-индуцированной23. Обратите внимание, что в нашей первой работе с использованием Клем учиться ВГС репликации21, был применен слегка модифицированную версию протокола, описанных здесь. В этом исследовании, обычных 0,05 мм толщиной Сапфировые диски, без буквенно-цифровой модели, были использованы в котором углерода, покрытие их с сеткой finder на вершине был создан шаблон ссылки (см. Таблицу материалы). Эта версия текущего протокола может применяться в конечном счете, с тем преимуществом, что «» перевозчик для ЖКХ может использоваться непосредственно, без необходимости резки его, как показано на рисунке 3A. Кроме того, как указано в протоколе, толще, «A» перевозчик может использоваться (см. Таблицу материалы) с рисунком Сапфировые диски, без необходимости перевозчик «B».
Интересно, что этот протокол может применяться не только для исследования образцов BSL-1, такие, как клетки transfected с вирусные белки как описано здесь и в других местах19,23, но и изучить инфицированные вирусом клетки. Хотя работа с патогенов человека обычно ограничивается лаборатории BSL-2 и BSL-3, в некоторых странах он все еще можно выполнять крио иммобилизации при этих условиях биобезопасности. В этих BSL-2 и лаборатории BSL-3, где витрификации не является возможным, благодаря местные предписания или отсутствие HPF машины инфицированные вирусом клетки могут по-прежнему готовиться с помощью этого метода, если химической фиксации с альдегиды осуществляется заранее, а именно перед отъездом BSL-2 или BSL-3 зал. Кроме того альдегиды нужно быть закаленных сразу после фиксации держать флуоресцирование, в то время как остальная часть протокола идентичен описанному здесь. Эта техника может считаться излишним потому что клетки являются фиксированными дважды, химически и через витрификации. Однако этот двойной фиксации протокол действительно приводит к гораздо лучше сохранение HCV-индуцированной DMV по сравнению с DMV, обнаруженные в клетках, подвергается химической фиксации только21.
Для дальнейшего изменения и устранения неисправностей читателя называется примечания на протяжении части протокола этой рукописи. Эти записи описывают, чтобы избежать ошибок, а также альтернатив для преодоления предполагаемые трудности, которые могут возникнуть при выполнении данного метода.
Основным условием применения этой техники является HPF машина. Когда крио иммобилизации клеток через HPF не осуществимо (из-за отсутствия HPF машины) или не требуется (при сохранение мембраны не нужно быть оптимальной), клетки могут быть химически фиксированной и впоследствии подготовлены и проанализированы в EM8, 9,10,11,12,13,14,,1516,17,18 ,19. Этот параметр не требует использования Сапфировые диски, но блюда культуры клеток с сетчатая шаблоны для перемещения ячейки или ячейки кластеров. Основным преимуществом использования этих блюд является их большего диаметра по сравнению с Сапфировые диски, позволяя скрининга больших площадей. Таким образом применение настоящего Протокола Клем успешно применялся для изучения эффекта противовирусное соединения против гепатита с15 или визуализировать перестановки мембраны, вызванных неструктурных белки норовирусов19. Еще один вопрос, который может ограничить производительность данного метода является отсутствие коммерческого устройства FS. В этом случае основные домашние системы FS может быть использован вместо. Хотя Автоматическая FS устройств может снизить обработки неудач, самодельные устройства успешно используются например в Кент Макдональд30 и Paul Walther лабораторий.
Что касается химической фиксации протокол, описанные здесь обеспечивает оптимальное сохранение внутриклеточных структур20. Таким образом в случае, если вышеупомянутые HPF и ФС устройства доступны, подрумянить клетки интереса будет предпочтительным.
Будущие альтернативы этому подходу Клем включают возможность использования этого метода не только приобрести 2D информацию на уровне ультраструктурных, но и для получения 3D-информацию об архитектуре мембраны и органелл изменений, вызванных вирусами. 3D-EM методы, включая электронная томография (ET) и целенаправленной Ион луч сканирование электронной микроскопии (FIB-SEM) (подробно описано в29), также могут применяться к ячейкам, которые были подготовлены после этого текущий протокол21, 31. Кроме того 3D информацию можно также получить на уровне LM, при использовании конфокального микроскопа, который позволяет приобретение z стеки. В самом деле этот вариант настоятельно рекомендуется, когда точные корреляции между LM и EM наборов данных является желаемой (см. например17). Информация, включенная в 3D z стеки помогает улучшить корреляцию с 2D изображений ТЕА. Таким образом в таком случае, лучший монтаж LM и EM изображения могут быть выбраны и затем подвергается одной корреляции программного обеспечения, например ec Клем плагин ЛЕДИСТО (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 или плагин ориентир соответствий Изображение J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), что приводит к генерации перекрывающихся изображений LM-EM.
Когда временная информация необходима для понимания кинетика определенного события, покадровой изображений может использоваться для мониторинга динамики живых клеток в сочетании с EM. В ходе мероприятия интерес клетки фиксируются немедленно, генерации «замороженные снимок», которые могут быть впоследствии проанализированы через EM, обеспечивая ультраструктурных подробно о том определенном моменте в то время иммобилизации. Для того чтобы получить что «замороженные снимка», после наблюдения в режиме реального времени, клетки может быть химически фиксированной33 или крио прикол6. Поскольку многие клеточные процессы происходят быстрее, чем диффузионные процессы химической фиксации, если возможно, ультра-быстрое замораживание должны быть выполнены. Однако важно принимать во внимание, что HPF машины отличаются в их эффективное время резолюции34.
Кроме того хотя этот протокол разработан для встраивания клеток в эпоксидной смоле, клетки могут быть также внедрены в низкой вязкости смолы, таких как Lowicryls, белый LR или LR золото. Использование этих средств внедрения позволяет сохранить антигенностью35,36, а также флуоресценции37,38 и, таким образом, в основном используются для после встраивания на раздел immunolabeling39 , 40 и на раздел Клем41,42,43,44, где LM делается после встраивания. Оба подхода (иммуно EM и на раздел Клем) должны быть исключительно важное значение для этих экспериментов, в которых не характеристика структуры могут быть легко найдены через ТЕА и/или как элемент управления против несоответствиях между LM и EM сигналов. Аналогичным образом, маркировки с антителами, которые могут быть визуализированы как визуализации формы (LM и EM) может осуществляться45 с целью, например, определить transfected клеток в LM (до встраивания этап) и добиться гораздо более точной локализации GFP сигнала через его конкретных маркировки, иммуно Эм (после внедрения этап). Это необходимо учитывать, однако, что permeabilization проводится до LM разрешить доступ антител к внутриклеточного пространства, которое может привести к неоптимальной сохранения архитектуры клеток на уровне EM. Интересно, что этот протокол также хорошо подходит для многоцветные экспериментов, может быть достигнуто с использованием других флуоресцентные метки, помимо GFP (как показано здесь). В заключение существует много предполагаемые возможности адаптации этот протокол, как на LM, так и по бокам EM, в зависимости от вопросов, которые рассматриваются в настоящее время. Для получения исчерпывающего описания других альтернативных протоколов читатель отсылался к5,46. Независимо от того, как объединяются формы микроскопии вместе получается прирост информации, позволяет нам лучше понять, как вирусы и их белки взаимодействуют с хозяевами в реальной жизни.
Наиболее важным шагом в рамках этого метода — это совокупность последовательных секций из клетки интереса. Как подчеркивается в разделе представитель результаты это требует специалистов, а также много терпения. Важно отметить, что этот шаг необходимо найти ячейки обратно на уровне EM по двум причинам. Во-первых в такого рода Клем протокола с использованием предварительно встраивание LM, координаты видны только на уровне LM и на лице блок смолы после встраивания. Однако они не будут видны на участках с ТЕА. Таким образом целевые обрезки на блок лицом вниз в регионах, представляющих интерес (ROI) должны быть выполнены тщательно с лезвием бритвы, чтобы гарантировать разделы, которые будут впоследствии получены клетки, выражая данный ПС. Во-вторых необходимо найти лучший наложение между LM и EM приобретений «сканирование» несколько разделов. В отличие от методов, где LM осуществляется на стадии после внедрения в этом случае LM-EM оверлей не так точно. Низкая оверлея точность является из-за различия в осевой резолюции LM и EM, усадка при обработке образцов EM и сжатие при резании42. Тем не менее эффективное отслеживание методы, например использование ориентиров, помочь найти клетки назад. Это включает в себя положение одной ячейки в другую, а также форма клеток и их ядра. В этой связи как указано в протоколе, DIC изображения обеспечивают «анатомической» информации клетки, которые имеют решающее значение для повышения корреляции. Кроме того ядер или другие органеллы хорошо узнаваемые ячейки (например митохондрий или липидов капельки) может быть пятнами до LM и используется в качестве ориентиров.
Наконец отметить, что хотя эта рукопись ориентирован на использование этой техники для исследования вирусологии, область этот экспериментальный дизайн может быть расширена для решения более общих биологических вопросов.

Идея объединения двух микроскопии условия для получения изображения более определенного биологического процесса довольно старый. Таким образом самого первого исследования о вирусах, используя «коррелятивных микроскопии» был опубликован в 1960 году как два отдельных публикаций1,2. В этом исследовании авторы проанализировали изменения в морфологии ядра, вызванных аденовирусов двумя методами микроскопии. В первой публикации сообщил1были электронной микроскопии (EM) наблюдения, описывая морфологические данные, связанные с аденовирусной инфекции. В второй публикации различные структуры, отмеченные EM коррелировали с изображениями световой микроскопии (лм) гистохимические окрашивание шаблонов, чтобы определить характер структуры, ранее отмеченные EM2.
В этих ранних исследованиях однако их замечания были проведены с использованием различных инфицированных клеток, подготовленных как независимые эксперименты. «Связь» действительно, означает как сочетание информации, поступающей из двух изображений условия понять некоторые явления, сравнивая все выводы, которые были получены с различных анализов с целью понять данного биологического процесс.
В настоящее время термин соотносится микроскопии, также известный как коррелятивных света и электронной микроскопии (Клем), применяется на большее количество методов (Обзор ссылки3,,45), с общность что оба методы визуализации (лм и EM) осуществляется на тот же образец. Сочетание обоих методов, таким образом, результаты в мульти-модальных, многомасштабный и многомерного анализа этого образца3. Преимущества, что LM может обеспечить широкий обзор многих различных клеток, обеспечение выявления субпопуляции клеток выражения протеина или протеинов интереса в гетерогенных клеток населения. ЕТ преодолевает резолюции предел LM, обеспечивая высокое разрешение изображения определенного внутриклеточных события. Кроме того EM позволяет визуализации не флуоресцентные субцеллюлярные контекста, включая все связаны мембраны органелл, большой макромолекулярных комплексов (например, рибосомы, centrioles и т.д.) и цитоскелетных элементов, тем самым предоставление дополнительных пространственной информации, так называемые «ссылка пространства»6и давая контекст на флуоресцентные место определяется LM.
В течение последних нескольких лет, Клем стал мощным инструментом не только для клеток биологи5, но и для вирусологи (обзор в ссылка7) готовы понять взаимодействие сложных вирусов клеток, которые приводят к распространению успешных вирус. Таким образом для разработки противовирусных препаратов для ликвидации патогенных вирусов важно понимание того, как вирусы изменяют мембран клеток и органелл в их собственных интересах.
Здесь Клем описан метод, позволяющий обнаружение, LM клеток, выражая вирусные белки, сливается с флуоресцентный белок (FP). Эти клетки являются впоследствии крио прикол и далее готов для ультраструктурных анализа через просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) чтобы получить новое понимание как выражение этих белков переставить внутриклеточные мембраны (рис. 1). Клем выступал с химически фиксированные клетки в большинстве исследований вирусологии, опубликованных до даты8,9,10,11,12,13,14 ,,1516,,1718,19. Это главным образом обусловлено необходимостью инактивации инфекционного материала по причинам биобезопасности в биобезопасности уровня-2 и -3 (BSL-2 и BSL-3) лаборатории, где крио иммобилизация клеток обычно не возможно. На эти вопросы, требующие оптимальное сохранение клеточных мембран витрификации через высокого давления замораживания (HPF) однако настоятельно рекомендуется20. В этих случаях может применяться протокол Клем, описанный здесь. Интересно особенно при работе с инфекционными образцов, HPF может выполняться на образцы, которые были ранее химически инактивированных, например в лаборатории BSL-2 и BSL-3. Сочетание химических фиксации следуют HPF является возможность прибыль по крайней мере частично, от преимущества крио сохранение методы21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Рисунок 1 : Схематическое представление рабочего процесса для анализа клеток через Клем. Клетки, растущих на узорной Сапфировые диски сначала анализируются LM для локализации клетки, выражая FPs до их обработки для EM. После обнаружения, клетки сразу же фиксируются HPF и FS впоследствии внедренных в смоле. После полимеризации смолы, поддержки, где росли клетки (= Сапфировые диски) должны быть удалены из блока смолой. Блок, содержащий внедренные ячейки усекается до небольшой трапеция, из которого являются секционного оставшиеся ячейки, выражая FPs, с алмазным ножом. Ультратонких секции собираются на слот сетки и дополнительно изучить ТЕА для получения ультраструктурных информации этих клеток. Эта цифра адаптирована и изменен с разрешения ссылки29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

Благодаря своей высокой резолюции электронной микроскопии (EM) является незаменимым инструментом для вирусологи. Однако одна из главных трудностей при анализе инфицированных вирусом или transfected клеток через EM являются низкая эффективность инфекции или трансфекции, препятствуя рассмотрению этих клеток. Чтобы преодолеть эту трудность, световой микроскопии (LM) может выполняться сначала выделить субпопуляция зараженных или transfected клеток. Таким образом воспользовавшись использование флуоресцентных белков (FPs) сливается с вирусные белки, LM используется здесь для записи позиции «положительный transfected» клеток, выражая FP и растет на подставке с буквенно-цифровым рисунком. Впоследствии клетки подвергались дальнейшей обработке для ет через высокого давления замораживания (HPF), заморозить замещения (FS) и внедрение смолы. Ультра-быстрой заморозки шаг обеспечивает отличную мембраны сохранение выделенных ячеек, которые затем могут быть проанализированы на уровне ультраструктурных, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА). Здесь при условии рабочий процесс шаг за шагом коррелятивных света электронной микроскопии (Клем), описывая пробоподготовки, изображений и корреляции в деталях. Экспериментальный дизайн также может применяться для решения многих вопросов биологии клетки.

Использование процедуры, представленные здесь (рис. 1), Huh7-Лунет клетки стабильно выражая T7-РНК-полимеразы были посеяны на дисках узорной сапфиры и впоследствии transfected с плазмида, выражая двумя доменами вируса гепатита С (HCV) неструктурных белок NS5A, отмеченных GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Рисунок 4). На следующий день, узорные Сапфировые диски, где росли клетки, были вывезены из блюд культуры клеток и образы с помощью лм (рис. 4, рис. 2). Эти клетки, выражая AH-D1-ГФП были определены наличием зеленый флуоресценции в цитозоле и Записанная сохранить свои позиции в пределах координат шаблон Сапфировые диски (цифры 5А, 5б). Сразу же после их рассмотрения LM, сапфировые диски, содержащие клетки интереса были собраны между двух алюминиевых несущих (рис. 3) и подвергли крио иммобилизация HPF. Клетки были затем заморозить замещенных и впоследствии внедренные в эпоксидную смолу.
После удаления Сапфировые диски от блоков полимеризованная смола отпечаток буквенно-цифровой шаблон был виден на лице блок, который позволяет извлечения области, где находились клетки интереса. Остальная часть смолы блок был отделан прочь для создания небольшой трапеция, укрывательство клетки интереса. Серийный ультратонких разделы были получены из этого трапеции, собранные на EM слот сетки и далее анализируются ТЕА (рис. 5C). Обратите внимание, что получение вручную серийный последовательных секций хотя возможно28 является трудоемким и требует хорошо подготовленных и квалифицированных кадров. Важно также, что клетки имеют низкий confluency, когда этот протокол Клем (рис. 5A) для того чтобы гарантировать быстрое признание той же ячейке, ранее выявленные LM. В противном случае имея высокий confluency клеток может резко замедлить успешное обнаружение клеток на уровне EM.
Анализ ТЕА из нескольких секций ультратонких клетки интереса (цифры 5 d, 5E), выражая AH-D1-GFP, показали наличие в своем внутриклеточным пространстве большого скопления везикулы переменной словотолкование делимитированной от окружающие цитозоль одного липидному (5 рисунокE).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Рисунок 4 : Схематическое представление рабочего процесса следует выполнить пример Клем, изображенные в Рисунок 5 . Huh7-Лунет клетки стабильно выражая T7-РНК-полимеразы были transfected с плазмида ДНК кодирования амфифильными спирали (AH) и домена 1 (D1) HCV NS5A белка, помеченный на его C-терминала с GFP (pTM_AH-D1-ГФП). Выражение этой части белка NS5A контролируется транскрипционно T7 промоутер (T7 вечера) и translationally encephalomyocarditis элементом IRES (внутренние рибосома запись сайта) вирус (EMCV), обозначается вторичной структуры. H двадцать четыре клетки после трансфекции (24 hpt) растет на узорной Сапфировые диски и выражая AH-D1-ГФП были обнаружены LM и немедленно подвергнут HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Рисунок 5 : Пример процедуры Клем. (A) Huh7-Лунет клетки, стабильно выражая T7 полимеразы анализируемой микроскопии флуоресцирования выделить GFP-положительных клеток, выращенных на узорной Сапфировые диски, 24 ч после трансфекции с плазмида pTM_AH-D1-GFP. (B) выше, увеличение изображения одной ячейки, выбранные в белый пунктирный прямоугольник для анализа Клем. (C) ТЕА изображение ультратонких часть той же ячейке после HPF, FS и встраивание смолы. (D) схематическое представление серийный 70-нм ультратонких секций на слот EM сетке, содержащей ячейку интерес. (E) на левой стороне: ТЕА описаниями двух секций клетки интереса. Справа: высокое увеличение изображений ТЕА внутриклеточных областей, выбранных в желтые прямоугольники на левой стороне, показывая высокое количество везикулы, разделенных от цитозоль через единый мембраны. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Корреляционные света электронной микроскопии (Клем) для отслеживания и обработки изображений вирусного белка связанные структуры в клетках, крио прикол

Корреляционные света электронной микроскопии (Клем) метод применяется к изображение вирус индуцированных внутриклеточных структур через электронной микроскопии (EM) в клетках, которые ранее выбранному световой микроскопии (лм). LM и EM комбинируются как гибридный подход изображений для достижения интегрированное представление взаимодействия вируса хост.

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-световой микроскопии этап Изготовление для Коррелированные Свет / Электронная микроскопия

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Вирусный наночастиц для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображения опухоли

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

В месте сжатие Загрузка и корреляционного неинвазивной визуализации кости-периодонтальной связки зуба волокнистых совместных

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптических изображений

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Изучение стехиометрии рецептор эпидермального фактора роста в интактных клетках, используя КОРРЕЛЯЦИОННЫМ микроскопия

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Коррелятивное свето- и электронной микроскопии с помощью Quantum Dot Наночастицы

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...