Name: correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells
Uploaded: 2018-09-07T15:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Vi är mycket tacksamma för anställda av elektronmikroskopi Core faciliteter (EMCF) vid EMBL (Heidelberg) och vid universitetet i Heidelberg. Vi vill också tacka Ulrike Herian, Stephanie Kallis och Andrea Hellwig (Heidelberg universitet), samt Eberhardt Schmidt och Renate Kunz (universitetar av Ulm) för teknisk experthjälp. Arbete av R.B. och hans team (U.H. och I.R.-B.) stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschafts, SFB1129, TP11 och TRR83, TP13.

1. beredning av mönstrade safir skivor för cellodling
<ol><li>Överföra de mönstrade safir skivor (se Tabell för material), med ett alfanumeriskt mönster etsade på en av deras ytor, i en 15 mL koniska centrifugering tub. Obs: Alternativt konventionella 0,05 mm tjock safir skivor utan alfanumeriskt mönster kan användas som en referens mönster skapas av kol beläggning dem med ett finder rutnät ovanpå. I detta syfte bör de rengöras med etanol innan kol mönstret appliceras.</li>
	<li>Tvätta dem med etanol. Sprida dem ute i en petriskål med filterpapper och låt dem torka. Placera dem på en glasskiva separat från varandra med hjälp av smal lång pincett.</li>
	<li>Kontrollera med ett inverterat Mikroskop (4 X förstoring) om mönstret av koordinater är läsbar på varje safir skiva. Obs: Om detta inte är fallet, flip safir skivorna med hjälp av pincetten.</li>
	<li>Lagra safir skivorna i en petriskål. Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>2. cellodling med mönstrade safir skivor
<ol><li>Sterilisera mönstrade safir skivorna med en ultraviolett (UV) crosslinker för 5 min.</li>
	<li>Ta safir skivorna till den cell kultur biosäkerhet skåp. Sterilisera den lång pincetten med etanol i biosäkerhet skåp.</li>
	<li>Tillsätt hälften av cellodlingsmedium (se Tabell för material) till en cell kultur maträtt. Överför safir skivorna försiktigt med en lång pincett till cell kultur skålen.</li>
	<li>Frö 1 x 105 Huh7-Lunet celler, stabilt uttrycker T7 polymerasen resuspended i den andra halvan av cellodlingsmedium, på kultur skålen. Obs: Beräkna antalet celler att dirigeras på ett sådant sätt att den cellen konfluens bör vara vid slutpunkten av experimentet inte över 20-30%. Hög cell densiteten kommer att hindra omlokaliseringar av cellerna i senare skeden av EM. Dessutom kan över-konfluens resultera i avskildheten av celler från safir skivorna.</li>
	<li>Kontrollera att safir skivorna ligga kvar på botten av skålen kultur och att alfanumeriska koordinaterna är fortfarande läsbara med inverterade mikroskopet. Obs: Om skivorna flyta i cellodlingsmedium, använda den lång pincetten att driva skivorna till botten och så småningom att vända dem tillbaka till rätt orientering.</li>
	<li>Transfect cellerna nästa dag som tidigare rapporterats i referenser21,23 efter transfection agentens tillverkarens anvisningar.</li>
</ol>3. LM avbildning av celler som växer på mönstrade safir skivor
<ol><li>Överföra safir skivorna vid slutpunkten av experiment till en tänkbar metallplatta som innehåller 30 – 50 µL / position av pH indikatorn-fri medium att minska ospecifik bakgrund fluorescens. Obs: Metallplattan beskrivs här (figur 2) har utformats på Europeiska Molecular Biology Laboratory (EMBL) verkstad. I avsaknad av denna platta eller ett liknande, kan glasbotten cell kultur rätter också användas i stället för LM. Det är viktigt att ändra den normala cellodlingsmedium för medium utan pH-indikator. Observera också att lång exponering gånger bör undvikas eftersom de kan orsaka fotoblekning, leder till reaktivt syre arter (ROS) ackumulering och fysiologisk skada celler24,25.</li>
	<li>Bild cellerna under en inverterad widefield fluorescens Mikroskop. Obs: När du använder ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta proteinet, som visas i de representativa resultat, 450 – 490 nm och 500 – 550 nm excitation och utsläpp filter, respektive bör användas.</li>
	<li>Skaffa först en låg förstoring bild (10 – 20 X) celler att allokera celler som uttrycker FPs. posten koordinaterna för mönstrade safir skivorna var cellerna av intresse finns med hjälp av differentiell störningar kontrast (DIC) mikroskopi. Obs: Sy flera områden kan hjälpa för att ha en bättre översikt över placeringen av cellen/cellerna av intresse. Observera att faskontrast mikroskopi kan valfritt användas här.</li>
	<li>Förvärva hög förstoring (fluorescens och DIC) bilder (63 – 100 X, Oljeimmer mål) av samma cell och celler bättre urskilja subcellulär lokalisering av proteinet av intresse inom det intracellulära utrymmet. Obs: DIC bilder ger sammanhangsberoende information. Denna information är ofta kritisk korrelera LM bilder med EM micrographs senare eftersom den slutliga korrelationen är mer exakt med ”anatomiska” sevärdheter i cellen. Som vissa safir skivor kan bryta under cryo-immobilisering, rekommenderas det starkt att förbereda exemplar per tillstånd. Dessutom lossna vissa celler från skivorna under HPF och de efterföljande stegen i detta protokoll, medan ultrastruktur av andra celler kan innehålla artefakter till följd av frysning skador. Därför bör åtminstone två områden skivor avbildas via LM att se till att i slutet kommer det att finnas tillräckligt med celler som ska analyseras. Ännu viktigare, bör dessa två områden på motsatta sidor av skivan. På detta sätt harts blocket där cellerna är inbäddade kan skäras i två halvor och delar av dessa områden kan erhållas.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig2.jpg"> Figur 2 : Schema för LM bildtagning av celler som växer på mönstrad safir skivor. (A) safir skivorna överförs med hjälp av fin pincett till ett imaging plate. (B-C) Denna platta har särskilt utformats vid EMBL workshop i Heidelberg för att passa in i ljusmikroskop, där safir skivorna kan avbildas med cellodlingsmedium utan pH-indikator. Den består av en metall bild, 75 mm x 25 mm x 1 mm, med fyra-fem hål mals till det med en 3 mm borr att passa storleken på safir skivorna. Dessutom var små spår frästa på varje sida av hålen i 90° vinkel. Dessa hål gör det lättare att komma åt skivorna med pincett när manipulera dem. För att möjliggöra optimal imaging villkoren var glas coverslips nr 0 (0,085 till 0,13 mm tjock) limmade nedanför hålen med UV lim och placeras under UV-ljus att härda. (D) hög förstoring bild av mönstrade safir skivan som skildrar de alfanumeriska koordinater som etsas på dess yta. Mönstrad safir skivorna är kommersiellt tillgängliga (se Tabell för material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
4. Cryo-immobilisering av celler som växer på mönstrade Sapphire skivor via HPF
<ol><li>Placera de ”A” och ”B” aluminium bärarna för HPF (se Tabell för material) i en petriskål med filterpapper indränkta i 1-hexadecene. Fördjupa de mönstrade safir skivor som innehåller celler i en petriskål med 1-hexadecene. Obs: Flytta skivorna lite att tvätta cellodlingsmedium bort.</li>
	<li>Montera safir skivorna mellan en A- och en ”B” aluminium bärare i HPF innehavaren enligt följande (figur 3B). På botten, placera en ”B-bärare med dess platta sidan uppåt. Placera safir skivor på denna platta sida med celler uppåt. Lägga till en ”en” bärare med dess 0,1 mm djup inför cellerna. Obs: Eftersom mönstrade safir skivorna är tjockare än de konventionella safir skivorna, kommersiellt tillgängliga ”A” transportören (utformade för att användas med icke-mönstrad 0,05-mm safir skivor) hade att skäras ner till 0,05 mm på denna 0,2 mm djup sida på EMBL Workshop för att passa i HPF hållaren (figur 3A). I detta syfte infogas ”A” flygbolaget i slutet av ett metallrör så att dess 0,2 mm sida är utsatt och förblir fortfarande medan skära. Skära ner sida sedan slipas så att den är platt. Alternativt en speciell aluminium bärare kan användas ovanpå mönstrade safir skivan (kommersiellt tillgängliga, se Tabell för material), som i detta fall HPF ”sandwich” består endast av safir skivan och detta lufttrafikföretag.</li>
	<li>Stäng hållaren av HPF maskinen och frysa cellerna. Obs: Detta protokoll är specifika för en viss HPF-maskin. Andra HPF maskiner kunde vara alternativt används6,26. I alla fall, vänligen var medveten om förekomsten av ny generation maskiner från leverantörer. Varning: Använd skyddsglasögon och hörsel skydd headset.</li>
	<li>
Lägg de frysta ”sandwich” i en polystyren förpackning med flytande kväve för tillfällig förvaring. FÖRSIKTIGHET: Använd skyddsglasögon och komma i kontakt med de lokala skyddsombud ska informeras om de potentiella farorna vid hantering av flytande kväve.<ol>
<li>För att undvika förvirring, placera varje ”sandwich” i ett separat 0,5 mL mikrocentrifug rör (inuti rutan polystyren) märkt med en siffra. Obs: Protokollet kan pausas här. Om frysa substitution (FS) inte kan utföras omedelbart, proverna kan lagras i kryorör (med ett hål stansas i topp) inuti lådor, som hålls i ett rack i en kryogen flytande kväve dewar (se Tabell för material). Denna flytande kväve behållare ska placeras i ett rum med oxygen gas sensorer, för att undvika kvävning vid en syrebrist. Varning: Alla de förfaranden som beskrivs nedan (steg 5 och 6) skall utföras i en biosäkerhet skåp. Dessutom är de flesta av de reagens som används farliga. Innan du använder dem, är det obligatoriskt att Läs noggrant de säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkarna, samt ställa skyddsombud om de lokala reglerna för säker hantering. För korrekt bortskaffande av dessa material som används, liksom för korrekt användning av den utrustning som beskrivs nedan, krävs det också att rådfråga institutets lokala hälso- och säkerhetsrutiner.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig3.jpg"> Figur 3 : Schemat för montering av mönstrade sapphire skivor mellan två aluminium bärare för HPF. (A) Cut-away utsikt över en konventionell ”A” bärare, som har att skäras på dess djupare sida från 0,2 mm till 0,05 mm. (B) 0,16 mm tjock safir skivan med alfanumeriska mönstret etsade på ytan är monterade i två aluminium bärare för HPF , enligt följande: safir skivan släpps ut på den platta sidan av en ”B-bärare med celler uppåt. En hackad ”en” transportör med dess 0,1 mm djup inför celler placeras ovanpå för att nära ”HPF smörgås”. Aluminium transportörer och mönstrade safir skivorna finns kommersiellt tillgänglig (se Tabell för material). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
5. FS Cryo-fasta celler
<ol><li>Fylla upp FS maskinen (se Tabell för material) med flytande kväve. Ställ in temperaturen till-90 ° C och vänta tills maskinen når denna temperatur.</li>
	<li>Förbereda FS mediet som innehåller 0,2% osmium vanligtvis (OsO4) (v/v), 0,1% uranyl acetat (UA) (w/v) i glas-destillerat aceton medan FS maskinen nedkylning. Obs: För att förbereda, (till exempel) 12 mL FS medium, blanda 600 µL av 4% OsO4med 0,012 g UA i en liten glasbehållare. Lös denna blandning i ett ultraljudsbad enhet för 5 min. Lägg till 11,4 mL glas-destillerat aceton med en pipett och blanda väl.</li>
	<li>Fylla upp 1,5 mL mikrocentrifugrör med 200-500 µL av FS medium, Stäng locket och överföra dem till FS maskinen. Vänta 10 min för FS mediet svalnar.</li>
	<li>Överföra de frysta ”smörgåsar” som innehåller safir skivorna med celler i flytande kväve med kylda lång pincett till rören som innehåller FS medium. Varning: Använd cryo-skyddande handskar och skyddsglasögon. Obs: HPF ”smörgåsar” kunde demonteras spontant under deras hantering. I detta fall se till att de frysta safirer skivorna överförs till mikrocentrifugrör. De aluminium bärarna kan kasseras.</li>
	<li>Kör i FS så här tills nästa dag27: från-90 ° C till 80 ° C för 8 h; från-80 ° C till-50 ° C i 8 h; från-50 ° C till-20 ° C för 2 h; från-20 ° C till 0 ° C för 2 h.</li>
</ol>6. harts inbäddning av frysa ersatt prover
Varning: Alla de förfaranden som beskrivs nedan skall utföras i en biosäkerhet skåp. Dessutom är de flesta av de reagens som används farliga. Innan du använder dem, är det obligatoriskt att Läs noggrant de säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkarna, samt ställa skyddsombud om de lokala reglerna för säker hantering. För korrekt bortskaffande av dessa material som används, liksom för korrekt användning av den utrustning som beskrivs nedan, krävs det också att rådfråga institutets lokala hälso- och säkerhetsrutiner.
<ol><li>Ta ut substituerade exemplaren från FS maskinen och placera dem på isen i 20 min.</li>
	<li>Förvara proverna i rumstemperatur i 20 min och tvätta dem noggrant (3 gånger, 10 min varje) med glas-destillerat aceton. Kassera de aluminium bärarna med lång pincett om de är fortfarande i mikrocentrifugrör efter FS.</li>
	<li>Infiltrera cellerna (på återstående safir skivor) i en fyra steg epoxi harts serie med 1 h inkubationer i 25%, 50% och 75% harts i glas-destillerat aceton, följt av natten inkubation med 100% harts. Utbyta 100% harts nästa dag för 1h.</li>
	<li>Noggrant placera safir skivor i genomflöde ringar monterade i reagens bad fylld med 100% harts. Dessa ringar används som polymerisation formar för 10 safir skivor. Obs: Safir skivorna måste helt skjutas till botten med koordinaterna uppåt på ett lättläst sätt. Detta kunde kontrolleras med hjälp av en kikare som bifogas en Rök utsug. Alternativt skulle en kikare släpper en biosäkerhet skåp kunna användas i stället. Ännu viktigare, finns det siffror (1-10) ingraverat på botten av de reagens som hjälper till att identifiera proverna.  För identifiering av proverna kunde dessutom en papper tagg ingå i blocket harts.</li>
	<li>Polymerisera proverna i ugnen på 60 ° C för 48 h.</li>
</ol>7. borttagning av mönstrade safir skivor från polymeriserat harts block
<ol><li>Ta bort hård harts block som innehåller celler från ugnen. Obs: Protokollet kan pausas här. Om inte, låt block svalna ner till rumstemperatur innan du skär dem.</li>
	<li>Skär inbäddning formarna med ett rakblad att ha tillgång till harts block. Ta bort cylindriska harts block med pincett. Obs: Om en papper-tagg inte har inkluderats i kådan blockera innan polymerisation, antal block med en permanent spritpenna och lagra dem i 1,5 mL mikrocentrifugrör. Protokollet kan pausas här.</li>
	<li>Doppa toppen av blocket harts innehållande safir skivan i en polystyren låda som innehåller flytande kväve tills det tar stopp ”bubblande”. Sedan doppa spetsen av harts blocket i kokande H2O.</li>
	<li>Upprepa de två föregående stegen så många gånger som behövs tills safir skivan faller bort av harts blocket. Varning: Använd skyddsglasögon och cryo-skyddande handskar. Obs: Om detta inte fungerar, använda ett rakblad för att ta bort lite av polymeriserat kådan runt skivorna innan du försöker igen. Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>8. riktade trimning och Ultrathin snittning för TEM
<ol><li>Identifiera området i harts block ansiktet där cellerna av intresse är närvarande genom att undersöka block ansiktet med kikärten av en ultramicrotome. Obs: Negativa avtryck av samordna mönstret från de mönstrade safir skivorna behålls på blocket ansiktet. Detta möjliggör identifiering av området där cellerna av intresse finns för riktade trimning. LM bilderna måste vändas vertikalt för att underlätta konstaterandet av samma position i block ansiktet.</li>
	<li>Trimma den inbäddade cell enskiktslager som innehåller cellen/cellerna av intresse för en liten platt pyramid med formen av en trapezium (~ 200 µm × 250 µm medelstorlek) med en ren rakblad.</li>
	<li>Få 70-nm ultrathin sektioner av inbäddade cellerna med 35° diamond kniv.</li>
	<li>Placera avsnitten på EM slot nät med hjälp av ultrafina pincett. Obs:: användning av mesh nät bör undvikas eftersom avsnitten kunde maskeras av rutnät barer.</li>
	<li>Förvara rutnäten i ett rutnät låda. Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
</ol>9. TEM analys av ultratunna sektioner
<ol><li>Placera rutnätet slot i innehavaren av transmissionselektronmikroskop. Förvärva låg förstoring (översikt) bilder, där komplett cell profilen av cellen av intresse är synlig. Obs:: cellen/cellerna av intresse finns tillbaka genom att använda cell profilerna och platserna för cellerna till en annan som referenser, jämföra DIC åsikter förvärvats före av LM.</li>
	<li>Förvärva hög förstoring bilder av cellen/cellerna av intresse, att försöka hitta, på ultrastrukturella nivå funktioner som motsvarar de fluorescerande signaler som observerats tidigare av LM. Obs: Montage bilder kan erhållas med hög förstoring att få en överblick på hög upplösning av cellen/cellerna av intresse. Dessutom är det ofta nödvändigt att förvärva bilder av samma cell i på varandra följande seriella sektioner för att kunna rekonstruera cellen i 3D innan jämföra till fluorescens bilder.</li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

CLEM metoden presenteras här för att studera effekterna av en viral proteinuttryck på cellmembran har använts framgångsrikt innan för att belysa den HCV replikering-associerade strukturer, främst dubbla membran blåsor (DMVs)21, samt att bestämma de kritiska byggstenar som krävs för att bilda dessa HCV-inducerad strukturer23. Observera att i vårt första arbete använder CLEM för att studera HCV replikering21, tillämpades en något modifierad version av protokollet som beskrivs här. Däri studie, konventionella 0,05 mm tjock safir skivor, utan alfanumeriskt mönster, användes som en referens mönster skapades av kol beläggning dem med ett finder rutnät ovanpå (se Tabell för material). Denna version av det nuvarande protokollet kan tillämpas så småningom, med fördelen att ”A” transportören för HPF kan användas direkt, utan att behöva skära som i figur 3A. Alternativt, som nämns i protokollet, en tjockare ”en” carrier kan utnyttjas (se Tabell för material) med mönstrade safir skivor, utan behov av en ”B-bärare.
Intressant, kan detta protokoll tillämpas inte bara att studera BSL-1 prover, såsom celler transfekterade med virusproteiner som beskrivs här och annorstädes19,23, men också att studera virusinfekterade celler. Även arbeta med mänskliga patogener är vanligtvis begränsad till BSL-2 och BSL-3 laboratorier, i vissa länder är det fortfarande möjligt att utföra cryo-immobilisering under dessa förhållanden för biosäkerhet. I dessa BSL-2 och BSL-3 laboratorier där förglasning inte är möjligt, på grund av lokala föreskrifter eller avsaknad av en HPF maskin, kan virus-infekterade celler fortfarande förberedas med den här metoden om kemiska fixering med aldehydes utförs i förväg, nämligen innan de lämnar de BSL-2 eller BSL-3 faciliteterna. Vidare behöver aldehyder kvävas omedelbart efter fixering att hålla fluorescensen, medan resten av protokollet är identisk med den som beskrivs här. Denna teknik kan anses överflödigt eftersom cellerna är fasta två gånger, kemiskt och via förglasning. Detta Dubbelrum fixering protokoll leder dock faktiskt till en mycket bättre bevarande av de HCV-inducerad DMVs i jämförelse med de DMVs som finns i celler utsätts för kemiska fixering enbart21.
För ytterligare ändringar och felsökning läsaren hänvisas till anteckningarna under hela den protokoll delen av detta manuskript. Dessa anteckningar beskriva fallgropar att undvika, samt alternativ till övervinna eventuella svårigheter som kan uppstå när du utför denna metod.
De huvudsakliga erforderliga för tillämpning av denna teknik är en HPF maskin. När cryo-immobilisera celler via HPF inte är genomförbar (på grund av frånvaron av en HPF maskin) eller inte krävs (när membranet bevarandet inte behöver vara optimal), celler kan kemiskt fast och därefter förberedas och analyseras av EM8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19. Detta alternativ kräver inte användning av safir skivor, men cellen kultur rätter med inrutade mönster för flyttar celler eller cell kluster. Den största fördelen med användningen av dessa rätter är deras större diameter jämfört med safir skivor, vilket gör att screening av större ytor. Tillämpningen av detta CLEM protokoll har således tillämpats framgångsrikt att studera effekten av en antiviral förening mot HCV15 eller att visualisera de membran rearrangements inducerad av ickestrukturella proteiner av Norovirus19. En annan fråga som kan begränsa prestanda för denna metod är avsaknaden av en kommersiell FS-enhet. I det här fallet kan grundläggande hemmagjord FS system utnyttjas istället. Även automatisk FS enheter kan minska hantering missöden, Hemmagjord enheter används framgångsrikt exempel på Kent Mcdonald's30 och Paul Walther labs.
Med avseende på kemiska fixering säkerställer protokollet beskrivs här ett optimalt bevarande av intracellulära strukturer20. Därför, om de ovannämnda HPF och FS-enheterna är tillgängliga, vitrifying celler av intresse skulle vara att föredra.
Framtida alternativ till detta CLEM synsätt inkluderar möjligheten att använda denna metod inte bara att förvärva 2D information på ultrastrukturella nivå, men också att få 3D information om arkitekturen av membran och organell förändringar orsakade av virus. 3D-EM metoderna, inklusive electron tomografi (ET) och fokuserad ion beam-scanning elektronmikroskopi (FIB-SEM) (utförligt beskrivs i29), kan också tillämpas på celler som har upprättats efter detta nuvarande protokoll21, 31. Dessutom kan 3D-information också erhållas på LM nivå, när du använder en confocal Mikroskop, vilket gör förvärvet av z-stackar. I själva verket rekommenderas detta alternativ när ett exakt samband mellan LM och EM datamängder är önskad (se till exempel17). Den information som ingår i 3D z-stackar aids att förbättra överensstämmelsen med 2D TEM bilder. Således, i ett sådant scenario, bäst passande LM och EM bilder kan väljas och sedan genomgå en av de tillgängliga, såsom EG-CLEM plugin av ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 eller landmärke korrespondenser plugin av korrelation Bild J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), vilket resulterar i generationen av överlappande LM-EM bilder.
När temporal information som behövs för att förstå kineticsen av en viss händelse, kan time-lapse imaging användas för att övervaka dynamiken i levande celler i kombination med EM. Under evenemanget av intresse korrigeras celler omedelbart generera en ”frusen ögonblicksbild” som kan analyseras därefter via EM, som ger detaljerad ultrastrukturella information om just det ögonblicket vid tidpunkten för immobilisering. För att få den ”frusen ögonblicksbilden”, efter observationen i realtid, kan celler vara antingen kemiskt fast33 eller cryo-orörlig6. Eftersom många cellulära processer sker snabbare än diffusion processerna för kemiska fixering, om möjligt, bör Ultra snabb nedfrysning utföras. Det är dock viktigt att beakta att HPF maskinerna skiljer sig åt i deras effektiva tiden resolution34.
Vidare, även om detta protokoll har utformats för för inbäddning av celler i ett epoxiharts, celler kan också bäddas in i låg viskositet hartser, såsom Lowicryls, LR vit eller LR guld. Användningen av dessa bädda media gör det möjligt för att bevara den antigenicitet35,36, samt fluorescens37,38 och, därför används mestadels för efter inbäddning på-sektionen immunolabeling39 , 40 och på-avsnitt CLEM41,42,43,44, där LM görs efter för inbäddning. Båda metoderna (immuno-EM och på-avsnitt CLEM) måste vara avgörande för dessa experiment där icke-karakteristiska strukturer kan lätt hittas via TEM eller som en kontroll mot miscorrelation mellan LM och EM signaler. Jämväl, märkning med antikroppar som kan visualiseras genom båda avbildningsmetoder (LM och EM) kan utföras45 för att, till exempel identifiera transfekterade celler i LM (pre inbäddning scenen) och uppnå en mycket mer exakt lokalisering av den GFP signal via dess särskilda märkning av immuno-EM (efter inbäddning Stadium). Det måste beaktas, men att permeabilisering görs före LM att tillåta åtkomst av antikroppar till intracellulära utrymmet, vilket kan resultera i ett optimalt bevarande av cell arkitektur på EM-nivå. Intressant, detta protokoll är också väl lämpad för flerfärgade experiment som kan uppnås med användning av andra fluorescerande taggar, än GFP (som visas här). Sammanfattningsvis finns det många förmodade möjligheter att anpassa detta protokoll, både på LM eller på EM sidorna, beroende på de frågor som behandlas. En omfattande beskrivning av andra alternativa protokoll hänvisas till5,46. Oavsett hur modaliteterna mikroskopi kombineras, är tillsammans resultatet en vinst av information, gör det möjligt för oss att bättre förstå hur virus och deras proteiner interagerar med sina värdar i verkliga livet.
Det mest kritiska steget inom denna metod är samlingen av seriell avsnitt från cellerna av intresse. Så framhävde i avsnittet representativa resultat kräver detta sakkunnig personal, samt en hel del tålamod. Detta steg är viktigt, viktigt att hitta celler tillbaka på EM-nivå av två skäl. Först i denna typ av CLEM protokoll använder pre inbäddning LM, visas koordinaterna endast på LM och i harts block ansiktet efter för inbäddning. Dock kommer de inte vara synliga på avsnitten av TEM. Därför skall riktade trimning i block ansiktet ner till regioner i intresse (ROIs) utföras noggrant med ett rakblad för att säkerställa att de avsnitt som erhålls därefter innehåller de celler som uttrycker en viss FP. Andra är ”skanna” flera sektioner nödvändigt att hitta bästa överlägget mellan LM och EM förvärven. Till skillnad från metoder där LM utförs efter inbäddning skede, är i detta fall överlägget LM-EM inte så exakt. Låg overlay noggrannheten beror på skillnader i axiell resolution LM och EM, krympning under provet bearbetningen av EM och komprimering vid snittning42. Dock bidra effektiv spårningsmetoder, såsom användning av sevärdheter, till att hitta celler tillbaka. Detta inkluderar en cell till en annan position, liksom formen av cellerna och deras kärna. I detta avseende, såsom förklaras i protokollet, ger DIC bilder ”anatomiska” information av de celler som är avgörande för att förbättra sambandet. Alternativt, kärnor eller andra väl-kända cell organeller (såsom mitokondrier eller lipid droppar) kan färgas innan LM och användas som landmärken.
Slutligen är det anmärkningsvärt att nämna att även detta manuskript är inriktat på användningen av denna teknik för virologi studier, omfattningen av denna experimentella design kan utökas för att mer generella biologiska frågor.

Idén att kombinera två mikroskopi modaliteter för att få en bättre bild av en specifik biologisk process är ganska gammal. Således publicerades den första studien om virus använder ”korrelat mikroskopi” 1960 som två separata publikationer1,2. I denna studie analyseras författarna förändringarna i morfologi av kärnan inducerad av adenoviruses med hjälp av två tekniker som mikroskopi. I den första publikationen var elektronmikroskopi (EM) observationer som beskriver de morfologiska detaljer i samband med adenovirus infektion rapporterade1. I en andra publikation, var olika strukturer observeras av EM korrelerade med ljusmikroskop (LM) bilder av histochemical färgning mönster, att definiera arten av de strukturer som tidigare observerats av EM2.
I dessa tidiga studier, men utfördes deras observationer med olika infekterade celler förberedda som oberoende experiment. ”Sambandet”, faktiskt, betyddes som kombinationen av information som kommer från två avbildningsmetoder att förstå ett visst fenomen, jämföra alla de resultat som har erhållits med olika analyser för att förstå en viss biologisk processen.
Numera appliceras termen korrelat microscopyen, även känd som korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM), på ett ökande antal metoder (över referenser3,4,5), med Gemensamheten att båda avbildningstekniker (LM och EM) utförs på samma prov. Kombinationen av båda metoderna resultat, därmed, i en multimodal, flerskalig och flerdimensionell analys av att prov3. Fördelarna är att LM kan ge en bred översikt av många olika celler, möjliggör identifiering av cell subpopulations uttrycker ett protein eller proteiner av intresse inom en heterogen cell befolkning. EM övervinner resolution gränsen för LM, vilket ger en högre upplösning bild av en viss intracellulära händelse. Dessutom möjliggör EM visualisering av icke-fluorescerande subcellulär ramen, inklusive alla membran bunden organeller, stora makromolekylärt komplex (t.ex. ribosomer, centrioles, etc.) och cytoskeletal element, därmed att tillhandahålla ytterligare rumsliga information, den så kallade ”referens utrymme”6, och ge sammanhang till fluorescerande plats upptäcks av LM.
Under de senaste åren, CLEM har blivit ett kraftfullt verktyg inte bara för cell biologer5, men också för virologer (ses i referens7) villig att förstå de komplexa virus-cell interaktioner som leder till en framgångsrik virus förökning. Thus, förstå hur virus ändra cellmembran och organeller till egen vinning är nödvändigt att utveckla antivirala läkemedel för att utrota lågpatogena virus.
Här, beskrivs en CLEM metod som gör upptäckten av LM av celler som uttrycker virusproteiner smält till en fluorescerande protein (FP). Dessa celler är därefter cryo-orörlig och vidare beredda för ultrastrukturella analys via transmissionselektronmikroskopi (TEM) att få nya insikter i hur uttrycket av dessa proteiner ordna intracellulära membran (figur 1). CLEM har utförts med kemiskt fast celler i de flesta virologi studier publicerade till datum8,9,10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Detta beror främst på behovet av inactivating smittsamt material för biosäkerhet skäl biosäkerhetsnivå-2 och-3 (BSL-2 och BSL-3) laboratorier, där cryo-immobilisering av celler inte är oftast möjligt. För de frågor som kräver en optimal bevarandet av cellmembranen, förglasning via högtryck frysning (HPF), dock rekommenderas20. I dessa fall kan det CLEM-protokollet som beskrivs här tillämpas. Intressant, särskilt vid arbete med infektiösa exemplaren, kan HPF utföras på prover som varit tidigare kemiskt inaktiverade, till exempel i BSL-2 och BSL-3 laboratorier. Kombinationen av kemisk fixering följt av HPF är en möjlighet att åtminstone delvis utnyttja fördelarna med kryo-bevarande metoder21,22.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig1.jpg"> Figur 1 : Schematisk representation av arbetsflödet för analys av celler via CLEM. Celler som växer på mönstrade safir skivor analyseras först av LM att lokalisera celler som uttrycker FPs innan deras bearbetning för EM. När ligger, korrigeras omedelbart celler av HPF och FS bäddas därefter i kåda. Vid polymerisation av harts, stöd där cellerna växer (= safir skivor) måste tas bort från blocket harts. Blocket som innehåller inbäddade celler trimmas till en liten trapezium som de resterande celler, som uttrycker FPs, är sektioneras med diamond kniv. Ultratunna sektioner samlas in på slot rutnät och undersökas ytterligare genom TEM få ultrastrukturella information av dessa celler. Denna siffra är anpassade och modifierad med tillstånd från referens29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2451px;" width="2450">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">UV Crosslinker</td>
			<td style="width:392px;">Stratagene</td>
			<td style="width:149px;">400072</td>
			<td style="width:1539px;">Stratalinker 1800, 230Vac, equipped with 254-nm UV light bulbs, 8-watts/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Patterned sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>627</td>
			<td>They have a 0.3-mm diameter and are 0.16-mm thick, as well as an an etched alphanumeric pattern to allow for re-location of the cells. They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Slim and long tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>72919-SS</td>
			<td>&#34;Style SS&#34;, for handling sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cell culture medium</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">41965-062</td>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 2 mM L-glutamine, nonessential amino acids, 100 units penicillin per ml, 100 &#181;g streptomycin per ml and 10% fetal calf serum (DMEM complete, see below). Package containing 10 bottles, 500 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">25030-123</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Nonessential amino acids</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">11140-068</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">15140-163</td>
			<td style="width:1539px;">Package containing 20 bottles of 100 ml/each.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:392px;">Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 50 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:392px;">Olympus Deutschland, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:149px;">CKX41</td>
			<td>It is an inverted microscope with trinocular head options and fluorescence upgrade capability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Huh7-Lunet cells stably expressing the T7 RNA-polymerase</td>
			<td style="width:392px;">Avaliable at Prof. Dr. Ralf Bartenschlager laboratory</td>
			<td style="width:149px;">Not available</td>
			<td style="width:1539px;">Contact Prof. Bartenschlager at: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Mirus TransIT-LT1 Transfection Reagent</td>
			<td>Mirus Bio LLC, Madison, USA</td>
			<td style="width:149px;">MIR 2304</td>
			<td style="width:1539px;">Broad spectrum, low toxicity, DNA transfection reagent. Vial of 0.4 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Inverted widefield fluorescence microscope</td>
			<td style="width:392px;">Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany</td>
			<td style="width:149px;">Zeiss Observer.Z1</td>
			<td style="width:1539px;">Inverted fluorescence microscope for experiments involving living cell cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-hexadecene</td>
			<td style="width:392px;">Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>8220640100</td>
			<td style="width:1539px;">Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;A&#34; aluminium holders for high pressure frezing (HPF)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>241</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol and has 2 different depths of 0.1 and 0.2-mm. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#34;B&#34; aluminium holders for HPF</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td>242</td>
			<td>This is the holder that has been used for this protocol.It is 0.3-mm thick.They can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:371px;">&#34;A&#34; aluminium holder for HPF (special for working with patterned sapphire discs)</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">737</td>
			<td style="width:1539px;">This is the holder than can be used alone with the patterned sapphire disc (as an alternative to the current protocol), without the need of a &#34;B&#34; holder or the edition of the &#34;A&#34; holder. It is 0.84-mm thick. It can be only ordered per e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sapphire discs</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, Sennwald, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">405</td>
			<td style="width:1539px;">These sapphires discs are the &#34;conventional&#34; one, with a 0.3-mm diameter and a thickness of 0.05 mm . They can be also used for CLEM as an alternative instead of patterned sapphire discs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Finder grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Philadelphia, USA</td>
			<td>LF135-Cu</td>
			<td style="width:1539px;">These 135 mesh grids are used to create an alphanumeric pattern on &#34;conventional&#34; sapphire discs (described above) via carbon coating, so that they can be used for CLEM. 100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">ABRA Fluid AG, Widnau, Switzerland</td>
			<td style="width:149px;">HPM 01</td>
			<td style="width:1539px;">This HPF machine has been used for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">HPF machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EMPACT 2</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;EMPACT 2&#34;, as an alternative to the use of the HPM machine that it has been used in this protocol (described above).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Cryo-tubes</td>
			<td style="width:392px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:149px;">Z763667-500EA</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen. Package containing 500 cryovials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Liquid nitrogen dewar</td>
			<td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany</td>
			<td style="width:149px;">GZ-05094-60</td>
			<td style="width:1539px;">For long term-storage of cryo-immobilized samples in liquid nitrogen, equipped with cryo-racks with a capacity of 1600 cryo-tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Automatic freeze substitution (AFS) machine</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">EM AFS2</td>
			<td>This machine performs freeze substitution and progressive lowering of temperature (PLT) techniques and allows low temperature embedding and polymerization of resins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Osmium tetroxide (OsO4)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>19150</td>
			<td>4% aqueous solution, one box containing 10 x 2 ml ampules.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uranyl-Acetate (UA)</td>
			<td>Serva, Heidelberg, Germany</td>
			<td>77879.01</td>
			<td>Bottle containing 25 grs of (UA)-2 H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Sonicator</td>
			<td style="width:392px;">Bandelin Electronic, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:149px;">329</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Sonorex Super RK 31&#34; is a high-power ultrasonic cleaning bath for aqueous cleaning solution that is used in this protocol to mix OsO4 and Ua when preparing the FS medium.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-distilled acetone</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>10015</td>
			<td>Bottle of 100 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:392px;">Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td style="width:149px;">Leica M80</td>
			<td style="width:1539px;">Routine stereomicroscope for daily inspections, equipped with a camera for capturing images.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Epoxy resin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td style="width:149px;">14120</td>
			<td style="width:1539px;">Embed 812 is a kit containing several components that must be mix together in the proportions given by the manufacturers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Flow through rings</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707157</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Reagent baths</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>16707154</td>
			<td>Package containing 100 pieces.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:371px;">Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>Ultramicrotome for preparation of semi- and ultrathin sections at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra 35&#176; diamond knife</td>
			<td>Diatome Ltd., Nidau 
			Switzerland</td>
			<td>AGG339-735</td>
			<td>This knife have an edge length of 3 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra fine tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>E78318</td>
			<td style="width:1539px;">&#34;Style 3X&#34;, for handling EM grids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM slot grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>G2010-Cu</td>
			<td>100 grids/vial.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EM grid storage box</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>71155</td>
			<td>It has capacity for 100 grids.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light electron microscopy (clem) for tracking and imaging viral protein associated structures in cryo-immobilized cells

På grund av dess hög upplösning är elektronmikroskopi (EM) ett oumbärligt verktyg för virologer. En av de största svårigheterna när du analyserar virus-infekterade eller transfekterade celler via EM är dock låg effektivitetsvinsterna av infektion eller transfection, hindrar undersökningen av dessa celler. För att övervinna denna svårighet, kan ljusmikroskopi (LM) utföras först för att allokera subpopulationen av infekterade eller transfekterade celler. Således att dra nytta av användningen av fluorescerande proteiner (FPs) smält till virusproteiner, LM används här att registrera positionerna för ”positiv-transfekterade” cellerna, uttrycker en FP och växer på ett stöd med ett alfanumeriskt mönster. Därefter celler bearbetas ytterligare för EM via högtryck frysning (HPF), frysa substitution (FS) och harts inbäddning. Det Ultra snabb frysning steget säkerställer utmärkt membran bevarandet av markerade celler som sedan kan analyseras på ultrastrukturella nivå av transmissionselektronmikroskopi (TEM). Här tillhandahålls en stegvisa korrelat ljus elektronmikroskopi (CLEM)-arbetsflödet, som beskriver provpreparering, imaging och korrelation i detalj. Experimentell design kan också användas för att åtgärda många cellbiologi frågor.

Proceduren presenteras här (figur 1), Huh7-Lunet celler stabilt uttrycker T7-RNApolymerasen var seedade på mönstrade safirer skivor och därefter transfekterade med en plasmid uttrycker två domäner av hepatit C-virus (HCV) ickestrukturella protein NS5A, märkta med GFP (pTM_AH-D1-GFP) (figur 4). Följande dag, mönstrade safir skivorna, där cellerna växer, togs ut ur cellen kultur rätter och avbildas med hjälp av LM (figur 4, figur 2). De celler som uttrycker den AH-D1-GFP identifierades av närvaron av grön fluorescens i cytosolen och spelas in för att spara sina positioner inom koordinat-mönstret safir skivor (siffror 5A, 5B). Omedelbart efter deras LM undersökningar, safir skivorna som innehåller celler av intresse var monterad mellan två aluminium bärare (figur 3) och utsätts för cryo-immobilisering av HPF. Cellerna var sedan frysa substituerade och därefter bäddas in i en epoxiharts.
Vid avlägsnande av safir skivorna från polymeriserat harts block var avtryck av alfanumeriska mönstret synlig i block-ansiktet, som tillät hämtar de områden där cellerna av intresse var belägna. Resten av kvarteret harts trimmats bort för att generera en liten trapezium härbärgerat cellerna av intresse. Seriell ultrathin sektioner erhållits från denna trapezium, samlades in på EM slot rutnät och ytterligare analyseras av TEM (bild 5C). Observera att erhålla manuellt följetong i följd sektioner visserligen genomförbart28 labor intensiv och kräver välutbildade och kompetenta personal. Det är också viktigt att cellerna har en låg konfluens när de utsätts för detta CLEM protokoll (figur 5A) för att garantera en snabb erkännande av samma cell tidigare identifierade av LM. Annars kan har högre cell konfluens dramatiskt sakta ner den framgångsrika lokalisering av celler på EM-nivå.
TEM analys flera ultrathin avsnitt av cellen av intresse (siffrorna 5 d, 5E), uttrycker den AH-D1-GFP, avslöjade förekomsten i dess intracellulära utrymmet i stora ansamlingar av blåsor av varierande morfologi avgränsade från den omgivande cytosol av en enda lipid lipidens (figur 5E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig4.jpg"> Figur 4 : Schematisk representation av arbetsflödet följt för att utföra exemplet CLEM skildras i Figur 5 . Huh7-Lunet celler stabilt uttrycker T7-RNApolymerasen var transfekterade med en DNA plasmid kodning den amfipatiska spiralen (AH) och domänen 1 (D1) av HCV NS5A protein, Taggad på sin C-terminal med GFP (pTM_AH-D1-GFP). Ett uttryck för denna del av proteinet NS5A styrs transcriptionally av en T7 promotorn (T7 Pm) och translationally av ett encephalomyocarditis virus (EMCV) IRES (intern Ribosomen inträde webbplats) element, indikeras av en sekundär struktur. 24 h efter transfection (24 hpt) celler växer på mönstrade safir skivor och att uttrycka den AH-D1-GFP upptäcktes av LM och omedelbart underkastas HPF-FS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58154/58154fig5.jpg"> Figur 5 : Exempel på CLEM procedurer. (A) Huh7-Lunet celler stabilt uttrycker T7 polymerasen analyseras av fluorescensmikroskopi allokera GFP-positiva celler odlas på mönstrade safir skivor, 24 h efter transfection med plasmiden pTM_AH-D1-GFP. (B) högre förstoring bilden av en enda cell valt inom den vit streckad rektangeln ska analyseras av CLEM. (C) TEM bild av ultratunna tvärsnitt av samma cell efter HPF, FS och harts inbäddning. (D) Schematisk bild av seriell 70-nm ultrathin sektioner på en slot EM rutnät som innehåller cellen av intresse. (E) på vänster: TEM översikter av två sektioner av cellen av intresse. Till höger: hög förstoring TEM bilder av de intracellulära områden som valts i gula rektanglar till vänster, avslöjar kick numrerar av blåsor avgränsade från cytosolen via ett enda membran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58154/58154fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells at JoVE.com

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Korrelat ljus elektronmikroskopi (CLEM) för att spåra och Imaging virala Protein associerade strukturer i Cryo-orörlig celler

En korrelat ljus elektronmikroskopi (CLEM) metod tillämpas på bild virus-inducerad intracellulära strukturer via elektronmikroskopi (EM) i celler som tidigare valts av ljusmikroskop (LM). LM och EM kombineras som en hybrid imaging strategi att uppnå en integrerad vy av virus-host interaktioner.

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Låg kostnad Cryo-ljusmikroskopi Stage Fabrication för korrelerade ljus / elektronmikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virala Nanopartiklar för<em&gt; In vivo</em&gt; Tumöravbildning

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In situ Tryck Lastning och Korrelat Noninvasive avbildning av ben-parodontal ligament-tand Fibröst Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Studie stökiometrin hos receptorn för epidermal tillväxtfaktor i intakta celler genom att använda Korrelat Mikroskopi

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

Korrelat Ljus- och elektronmikroskopi Använda Quantum Dot Nanopartiklar

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Ljus-ark fluorescensmikroskopi för studien av murina hjärtat

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...