Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر مكتب البريد البكالوريا علماء البرنامج ومعاهد نوفارتيس "البحوث الطبية الحيوية" ككل من أجل تمويل هذه الدراسة.

1-إعداد الخلايا
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول، بما في ذلك توليد البيانات، الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع باكولوفيروس ترميز الخلايا NR1 و NR2A.
<ol><li>البذور عدد مناسب من الخلايا HEK293 وإضافة NR1 و/أو NR2A الفيروس بتركيزات النهائية المناسبة (1.00 ميليلتر في كل). لوحة 384، حسنا، استخدم 10,000 الخلا?...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

يعتمد نجاح هذا التحليل إلى حد كبير على صحة الخلايا HEK المستخدمة. الخلايا تشهد نمواً متسارعا وينبغي أن تستخدم بعدد مرور منخفضة. هذا التحليل ينطوي على العديد من عمليات النقل وإضافات حلول، وذلك باستخدام الحذر سوف ضمان دقة أعلى في نتائجه. ينبغي أن تكون تركيزات مركبات وجميع الكواشف الأخرى أيضا ...

مع التقدم الحالي في الطب، ازداد متوسط العمر المتوقع إلى حد كبير؛ ومع ذلك، قد ذلك انتشار الأمراض المرتبطة بالسن. أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) مثل الفصام والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض الزهايمر ومرض باركنسون، بين أمور أخرى، ليست استثناء، وقد كان المتوقع أن تزيد على مدى العقد القادم1، 2 , 3-خلل مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك المعروف باسم N-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (نمدار) ارتبط بمرض الزهايمر والفصام وإصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والسكري والزرق بين أمور أخرى، مما يستلزم بحاجة إلى دراسة هذه الأحياء لتطوير علاجات فعالة، والمرض--تعديل4،5،،من67.
نمدارس تتألف من أربعة مونومرات أو الوحدات الفرعية4،،من89. ويبين تشكيل الهيكلية نمدار تقلب التنموية والإقليمية داخل المخ7،10. وتشارك نمدارس في اللدونة متشابك، والإدراك، وتوليد إيقاعات للتنفس والحركة11،،من1213. كقناة لبوابات الجهد، إلى حد كبير غير إجراء في استراحة غشاء المحتملة (-70 mV) وتم حظره بواسطة الماغنسيوم لمنع المزيد من تخلل للايونات. القناة يتم تفعيلها من خلال ربط يغاندس اثنين وغلوتامات جليكاين/د-سيرين، وتوسط depolarization متزامنة في الغشاء متشابك مستقبلات امبا، فئة فرعية أخرى من مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك. ديبولاريزيشن يزيل انسداد المغنيسيوم نمدار، تمكين تدفق الاتصالات، لا سيما الكالسيوم14،،من1516. على الرغم من أن تنشيط نمدار ضروري لبقاء الخلية، يمكن أن يؤدي التنشيط المفرط الخلية وفاة17،،من1819 من خلال اكسسيتوتوكسيسيتي. هذا، بالإضافة إلى الطبيعة المعقدة للمستقبلات، يجعل من تحدي لإجراء الدراسات اللازمة لتطوير علاجات فعالة.
وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة نمدار. ومع ذلك، كل واحد لديه المصاحبة للمحاذير. على سبيل المثال، إحدى التقنيات المستخدمة على نطاق واسع هو تحليل القائم على الأسفار الذي يقيس التغيرات نمدار بوساطة في الكالسيوم داخل الخلايا في خط خلية مستقرة تحت سيطرة مروج التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في)20. ومع ذلك، في هذا النظام، سوبراماكسيمال وتركيزات يغاندس مطلوبة وشرط أن مثبطات نمدار موجودة أثناء أخذ القياس يجعل من المستحيل تقريبا للكشف عن النشاط لخصم تنافسية. وفي نظم أخرى مماثلة، يسبب التعبير عن مستقبلات الوظيفية السمية، التي تتطلب محصرات قنوات مثل الكيتامين21،22 الحفاظ على الثقافات الخلية. الجلوس في صميم المستقبلات هذه محصرات قنوات ويصعب أن يغسل بها، لا سيما في شكل لوحة، حيث تتداخل مع الدراسات الفنية للمستقبلات. وأخيراً، في القياسات الكهربية مثل لقط التصحيح، هناك إنتاجية محدودة، ودراسات واسعة النطاق، هي مكلفة جداً23. على الرغم من أنظمة المذكورة أعلاه حساسة لتحفيز جليكاين؛ ومن ثم دراسة جليكاين-تعتمد على نشاط نمدار يصبح تحديا.
وهنا يصف لنا نهجاً جديداً لدراسة نمدار أن يتغلب على القيود التي نوقشت. لدينا أسلوب يستغل نظام التعبير باكولوفيروس للتعبير عن مستقبلات على المستويات الوظيفية مع نسبة مثلى للوحدات الفرعية بأقل قدر من 16 ساعة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام باكولوفيروس لنهج بسيط والتوافقي، الذي يوفر وصفاً واسعة من الأنواع الفرعية نمدار المؤتلف متميزة. وخلافا لفحوصات أخرى، لا يتطلب هذا البروتوكول محصرات قنوات بسبب استخدام الخصوم ضعيفة. ميزة أقوى للأسلوب تبييض بعد ذلك لخصم ضعيف، والمستقبلات حساسة لتحوير مواقع الربط جليكاين وغلوتامات الفردية بالإضافة إلى التعديل المزدوج جليكاين/د-سيرين وغلوتامات ملزم يجند المواقع. ويجمل المقايسة الأدوية المعروفة لمستقبلات نمدار وآثار به المغيرون إيجابية وسلبية معروفة. أخيرا، السمية الخلوية الناتجة عن تدفق الكالسيوم المفرط ويتغلب على توليد هذه في المختبر الخلوية المقايسة ويسمح للدراسات الفنية من المستقبلات في طريقة الفائق، التي يمكن أن تعجل باكتشافات المغيرون نمدار في الحالات المرضية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

ن-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (NMDA) (نمدار) تصنف مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك وأدوار حاسمة في التعلم والذاكرة. عطل نمدار، أعرب أما أكثر-أو وكيل-activity الناجم عن الطفرات، تغيير تعبير أو الاتجار أو التعريب، يمكن أن يسهم في العديد من الأمراض، وبخاصة في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فهم البيولوجيا المستقبلات، فضلا عن تيسير اكتشاف المركبات والجزيئات الصغيرة حاسمة في الجهود المبذولة لمكافحة الأمراض العصبية. النهج الحالي لدراسة المستقبلات لها حدود بما في ذلك انخفاض الإنتاجية والتكلفة العالية وعدم القدرة على دراسة قدراته الفنية نظراً لوجود الضرورة محصرات قنوات للحيلولة دون وساطة نمدار اكسسيتوتوكسيسيتي. بالإضافة إلى ذلك، نظم التحليل القائمة حساسة للتحفيز قبل غلوتامات فقط وتفتقر إلى الحساسية للتحفيز التي جليكاين، يجند المشارك الأخرى نمدار. نقدم هنا، التحليل القائم على اللوحة الأولى مع السلطة الفائق للدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية لكلا يغاندس المشارك وغلوتامات د-سيرين/جليكاين. هذا النهج يتيح دراسة التراكيب وحدة فرعية نمدار مختلفة ويسمح الدراسات الفنية للمستقبلات في أوضاع جليكاين-و/أو الحساسة غلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة لا تتطلب وجود مثبطات خلال القياسات. ويمكن الكشف عن آثار المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية مع هذا التحليل والأدوية المعروفة من نمدار تكررت في نظامنا. هذا الأسلوب يتغلب على أوجه قصور الأساليب القائمة، وفعالة من حيث التكلفة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية الجديدة سوف تعجل باكتشاف العلاجات للأمراض بوساطة نمدار.

قبل اختبار آثار الجزيئات الصغيرة، واحد يجب أن تحدد مستويات التعبير الأمثل نمدارس، فضلا عن تركيزات يجند الأمثل. كما هو موضح، HEK293 كانت تبذر الخلايا في الخلايا 10,000 كل بئر في صفيحة 384، حسنا، حضور 5 ميكرومتر CGP060667، ثم ترانسدوسيد بمقادير متفاوتة من NR1 و NR2A الفيروسات. تم قياس الجر...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

مقايسة الفائق كالسيوم-التمويه لدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية جليكاين/د-سيرين وغلوتامات

والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

طريقة بسيطة لقياس حساسية الايثانول في الذباب

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

ضوء الفحص ميول لدراسة الساعة البيولوجية الفطرية وPhotobehavior الخاضعة للرقابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...