Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
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Les auteurs aimeraient remercier le Post baccalauréat Scholars Program Office et Novartis Institutes for BioMedical Research dans son ensemble pour le financement de cette étude.

1. préparation des cellules
Remarque : Le présent protocole, y compris la génération de données, utilise les cellules HEK293 transduites avec un encodage NR1 et NR2A cellules de baculovirus.
<ol><li>Le nombre de cellules HEK293 approprié de graines et ajouter le virus NR1 et/ou NR2A aux concentrations finales appropriées (1,00 µL). Pour une plaque 384 puits, utiliser 10 000 cellules/puits dans un volume final de 30 µL.</li>
	<li>Sinon, les cellules HEK293-NR1-NR2A graines dans la c...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. 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A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

La réussite de ce test dépend largement de la santé des cellules HEK utilisé. Les cellules en croissance exponentielle et au nombre de passage bas doit être utilisé. Ce test comporte de nombreux transferts et ajouts des solutions, donc attention, en utilisant assurera une plus grande précision dans ses résultats. Les concentrations de composés et de tous les autres réactifs doivent être également une vérification croisée afin de minimiser les erreurs. Lors du remplacement des milieux cellulaires avec le tam...

Avec les progrès actuels en médecine, l’espérance de vie a augmenté de façon significative ; Toutefois, il a donc la prévalence des maladies liées au vieillissement. Maladies du système nerveux central (CNS) tels que la schizophrénie, sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie d’Alzheimer et de Parkinson, entre autres, ne font pas exception et ont été devrait pour augmenter au cours de la prochaine décennie1, 2 , 3. le défaut de fonctionnement des récepteurs du glutamate ionotropiques appelés récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) a été liée à la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral, diabète et glaucome parmi d’autres, qui garantit la besoin d’étudier leur biologie pour le développement de thérapies efficaces, modificateurs4,5,6,7.
Récepteurs NMDA est composées de quatre monomères ou sous-unités4,8,9. La composition structurelle de la NMDAR montre la variabilité régionale et de développementale dans le cerveau7,10. Récepteurs NMDA est impliqués dans la plasticité synaptique, la cognition et la génération des rythmes respiratoires et locomotion11,12,13. Comme un canal de voltage-dépendants, c’est en grande partie non conducteur à potentiel membranaire de repos (-70 mV) et est bloquée par le magnésium pour prévenir d’autres perméation des ions. Le canal est activé par la liaison de deux ligands, glutamate et glycine/D-sérine et une dépolarisation simultanée au niveau de la membrane synaptique médiée par les récepteurs AMPA, une autre sous-classe des récepteurs ionotropiques du glutamate. La dépolarisation supprime le blocage de magnésium de la NMDAR, permettant l’afflux des cations, en particulier calcium14,15,16. Même si l’activation des NMDAR est essentielle pour la survie des cellules, activation excessive peut conduire à la mort17,18,19 à l’excitotoxicité de cellules. Cela, en plus de la nature complexe du récepteur, fait qu’il est difficile d’effectuer des études nécessaires au développement de thérapies efficaces.
Différentes méthodes ont été développées pour étudier le NMDAR. Cependant, chacun a accompagnant les mises en garde. Par exemple, une technique largement utilisée est un test par fluorescence qui mesure les changements NMDAR en calcium intracellulaire dans une lignée cellulaire stable sous le contrôle d’un promoteur inductible par la tétracycline (Tet-On)20. Cependant, dans ce système, les concentrations de supramaximal de ligands qui sont nécessaires et l’exigence que les inhibiteurs NMDAR sont présents lors de la mesure rend presque impossible de détecter l’activité de l’antagoniste compétitif. Dans d’autres systèmes similaires, l’expression du récepteur fonctionnel provoque la toxicité, exigeant que les bloqueurs des canaux calciques comme la kétamine21,22 , afin de préserver les cultures cellulaires. Ces inhibiteurs des canaux calciques s’asseoir au centre du récepteur et sont difficiles à laver, surtout dans un format de plaque, afin qu’ils interfèrent avec des études fonctionnelles du récepteur. Enfin, des mesures électrophysiologiques comme correctif de serrage, il y a un débit limité, en études à grande échelle sont très cher23. Nonobstant, les systèmes ci-dessus sont insensibles à la stimulation de la glycine ; étude de l’activité de la glycine-dépendante de la NMDAR devient donc un défi.
Nous décrivons ici une nouvelle approche pour l’étude de NMDAR qui surmonte les limites discutés. Notre technique capitalise sur le système d’expression baculovirus pour exprimer le récepteur au niveau fonctionnel avec un rapport optimal des sous-unités en aussi peu que 16 heures. Par ailleurs, l’utilisation de baculovirus permet une approche simple et combinatoire, qui prévoit une large caractérisation des sous-types distincts recombinants NMDAR. Contrairement à d’autres épreuves, ce protocole ne nécessite pas de bloqueurs des canaux calciques en raison de l’utilisation des antagonistes des faibles. Les plus fort avantage de la méthode est qu’après sevrage de l’antagoniste faible, le récepteur est sensible à la modulation des sites individuelle glycine-glutamate-liaison et en plus double modulation de glycine/D-sérine et glutamate ligands sites. Le dosage récapitule la pharmacologie connue du récepteur NMDAR et les effets de ses modulateurs positifs et négatifs connus. Enfin, génération de ce test cellulaire in vitro surmonte la toxicité cellulaire provoquée par l’influx de calcium excessif et permet des études fonctionnelles du récepteur dans un mode haut débit, qui peut accélérer les découvertes des modulateurs NMDAR dans les États de la maladie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) (NMDAR) sont classés comme des récepteurs de glutamate ionotropiques et ont un rôle essentiel dans l’apprentissage et la mémoire. Dysfonctionnement des NMDAR, exprimé comme soit plus - ou moins - sous‑activité causée par des mutations, une expression altérée, trafic ou la localisation, peut contribuer à nombreuses maladies, en particulier dans le système nerveux central. Comprendre la biologie du récepteur mais aussi de faciliter la découverte de composés et de petites molécules est donc crucial dans les efforts visant à lutter contre les maladies neurologiques. Les approches actuelles à l’étude du récepteur ont des limites y compris de faible débit, coût élevé et l’impossibilité d’étudier ses capacités fonctionnelles dues à la présence nécessaire des bloqueurs de canaux afin d’empêcher l’excitotoxicité médiée par NMDAR. En outre, les systèmes de dosage sont sensibles à la stimulation par le glutamate seulement et manquent de sensibilité à la stimulation par la glycine, le ligand autre co de la NMDAR. Nous présentons ici le premier dosage basé sur plaque avec puissance de haut débit afin d’étudier un récepteur NMDA avec sensibilité à la fois des ligands CO, glutamate et D-sérine/glycine. Cette approche permet l’étude de différentes compositions de sous-unité NMDAR et permet des études fonctionnelles du récepteur en modes glycine - et/ou sensibles au glutamate. En outre, la méthode ne requiert pas la présence d’inhibiteurs pendant les mesures. Les effets de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs peuvent être détectées avec ce dosage et la pharmacologie connue des NMDAR a été reproduite dans notre système. Cette technique permet de surmonter les limites des méthodes existantes et est rentable. Nous pensons que cette nouvelle technique permettra d’accélérer la découverte de thérapies pour des pathologies NMDAR-mediated.

Avant de tester les effets de petites molécules, il faut déterminer les niveaux d’expression optimale de NMDAR ainsi que les concentrations du ligand optimale. Tel que décrit, HEK293 cellules ont été injectées à 10 000 cellules par puits dans une plaque 384 puits, en présence de 5 µM CGP060667, puis transduites avec des quantités variables de NR1 et NR2A virus. Après incubation pendant la nuit, induite par le ligand calcium flux a été mesurée (Figure 1...

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A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Un dosage de haut-débit-flux de Calcium pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la Glycine/D-sérine et Glutamate

Le but du présent protocole est de faciliter l’étude des récepteurs NMDA (NMDAR) à grande échelle et de permettre l’examen des effets modulateurs de petites molécules et leurs applications thérapeutiques.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Corrélative microscopie optique et électronique pour l&#39;étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...