Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare il Post Diploma di maturità Scholars Program Office e Novartis Institutes for BioMedical Research nel suo complesso per il finanziamento di questo studio.

1. preparazione delle celle
Nota: Questo protocollo, tra cui la generazione dei dati, utilizza cellule HEK293 trasformate con un baculovirus codifica NR1 e NR2A cellule.
<ol><li>Il numero appropriato di cellule HEK293 di semi e aggiungere il virus NR1 e/o NR2A alle concentrazioni finali appropriate (da 1.00 µ l). Per un piatto di 384 pozzetti, utilizzare 10.000 cellule/pozzetto in un volume finale di 30 µ l.</li>
	<li>In alternativa, seme cellule HEK293-NR1-NR2A presso il numero di cella a...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. 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A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

Il successo di questo test dipende in gran parte la salute delle cellule HEK utilizzato. Le cellule in fase di crescita esponenziale e con numero di passaggio basso dovrebbe essere usato. Questo test comporta molti trasferimenti e aggiunte di soluzioni, così uso attenzione garantirà maggiore precisione nei suoi risultati. Concentrazioni di composti e di tutti gli altri reagenti dovrebbero essere anche controllato per minimizzare gli errori. Quando si sostituisce media delle cellule con il buffer di analisi per il dosag...

Con attuali progressi in medicina, l'aspettativa di vita è aumentata in modo significativo; Tuttavia, così ha la prevalenza delle malattie età-correlate. Malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come schizofrenia, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson, tra gli altri, non fanno eccezione e sono stati progettati per aumentare sopra il prossimo decennio1, 2 , 3. il malfunzionamento del noto come recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) dei recettori ionotropi del glutammato è stato collegato al morbo di Alzheimer, schizofrenia, trauma cranico, ictus, diabete e glaucoma tra gli altri, che garantisce la bisogno di studiare la loro biologia per lo sviluppo di terapie efficaci, modificante la malattia4,5,6,7.
NMDARs sono composti da quattro monomeri o subunità4,8,9. La composizione strutturale della NMDAR Mostra variabilità inerente allo sviluppo e regionali entro il cervello7,10. NMDARs sono coinvolti nella plasticità sinaptica, cognizione e la generazione dei ritmi per respirazione e locomozione11,12,13. Come un canale voltaggio-dipendente, è in gran parte non conduttore al potenziale di membrana a riposo (-70 mV) e viene bloccato da magnesio per prevenire ulteriori permeazione degli ioni. Il canale è attivato dall'associazione di due ligandi, glutammato e glicina/D-serina, e una depolarizzazione simultanea alla membrana sinaptica mediata da recettori AMPA, un'altra sottoclasse di recettori ionotropici del glutammato. La depolarizzazione rimuove il blocco di magnesio di NMDAR, consentendo l'afflusso dei cationi, in particolare calcio14,15,16. Anche se l'attivazione di NMDAR è essenziale per la sopravvivenza delle cellule, attivazione eccessiva può portare a cellule morte17,18,19 attraverso excitotoxicity. Questo, oltre la complessa natura del recettore, rende difficile effettuare studi necessari per lo sviluppo di terapie efficaci.
Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la NMDAR. Tuttavia, ciascuno di essi è corredato da avvertimenti. Ad esempio, una tecnica ampiamente utilizzata è un'analisi di fluorescenza-basata che misura i cambiamenti di NMDAR-mediati in calcio intracellulare in una linea cellulare stabile sotto il controllo di un promotore inducibile tetraciclina (Tet-On)20. Tuttavia, in questo sistema, le concentrazioni di sopramassimale di ligandi che sono necessari e l'obbligo che gli inibitori di NMDAR sono presenti durante la misurazione rende quasi impossibile rilevare l'attività dell'antagonista competitivo. In altri sistemi simili, l'espressione del recettore funzionale provoca tossicità, che richiedono di bloccanti dei canali come ketamina21,22 per preservare le colture cellulari. Questi antagonisti sedersi al centro del recettore e sono difficili da lavare fuori, soprattutto in un formato basato su piastra, in modo da interferire con gli studi funzionali del recettore. Infine, nelle misurazioni elettrofisiologiche come patch di bloccaggio, c'è la velocità effettiva limitata e studi su larga scala sono molto costosi23. Nonostante, i sistemi di cui sopra sono insensibili alla stimolazione di glicina; quindi, studiando attività di glicina-dipendente del NMDAR diventa una sfida.
Qui, descriviamo un nuovo approccio per lo studio di NMDAR che supera le limitazioni discusse. La nostra tecnica sfrutta il sistema di espressione di baculovirus per esprimere il recettore a livello funzionale con un rapporto ottimale delle subunità in meno di 16 ore. Inoltre, l'uso di baculovirus consente un approccio semplice e combinatorio, che fornisce un'ampia caratterizzazione dei sottotipi distinti ricombinante NMDAR. A differenza di altri saggi, questo protocollo non richiede bloccanti dei canali a causa dell'uso di antagonisti deboli. Vantaggio più forte del metodo è quello dopo interruzione dell'antagonista debole, il recettore è sensibile alla modulazione dei siti individuali della glicina e del glutammato-associazione oltre a doppia modulazione di glutammato e glicina/D-serina ligand-legantesi siti. Il dosaggio ricapitola noto farmacologia del recettore NMDAR e gli effetti dei suoi noti modulatori positivi e negativi. Infine, generazione di questo test in vitro cellular supera la tossicità cellulare causata da afflusso del calcio eccessivo e permette per studi funzionali del recettore in un modo ad alta velocità, che può accelerare le scoperte dei modulatori NMDAR negli Stati di malattia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

I recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) sono classificati come recettori ionotropici per il glutammato e hanno importanti ruoli nell'apprendimento e nella memoria. Malfunzionamento NMDAR, espresso come entrambi sopra - o sotto - activity causata da mutazioni, espressione alterata, traffico o localizzazione, può contribuire a numerose malattie, soprattutto nel sistema nervoso centrale. Di conseguenza, comprensione della biologia del ricevitore, nonché facilitare la scoperta di composti e piccole molecole è cruciale nei continui sforzi per combattere le malattie neurologiche. Attuali approcci allo studio del recettore presentano limitazioni tra cui bassa velocità effettiva, costo elevato e l'impossibilità di studiare le relative abilità funzionale dovuto la necessaria presenza di bloccanti dei canali per evitare eccitotossicità mediata NMDAR. Inoltre, gli attuali sistemi di dosaggio sono sensibili alla stimolazione da glutammato solo e la mancanza di sensibilità alla stimolazione da glicina, altri co-ligando del NMDAR. Qui, presentiamo il primo test basati su piastra con potenza di alto-rendimento per studiare un recettore NMDA con sensibilità sia co-leganti, glutammato e glicina-serina/D. Questo approccio consente lo studio delle diverse composizioni di subunità NMDAR e studi funzionali del recettore in modalità glicina - e/o sensibili al glutammato. Inoltre, il metodo non richiede la presenza di inibitori durante le misurazioni. Gli effetti di modulatori allosterici positivi e negativi possono essere rilevati con questo test e la farmacologia nota di NMDAR è stata replicata nel nostro sistema. Questa tecnica supera le limitazioni dei metodi esistenti ed è conveniente. Noi crediamo che questa tecnica novella ad accelerare la scoperta di terapie per patologie mediate da NMDAR.

Prima di testare gli effetti di piccole molecole, si devono determinare i livelli di espressione ottimale di NMDARs così come le concentrazioni di ligando ottimale. Come descritto, HEK293 cellule sono state seminate a 10.000 cellule per pozzetto di una piastra a 384 pozzetti, in presenza di 5 µM CGP060667, quindi trasdotte con quantità variabili di NR1 e NR2A virus. Dopo incubazione overnight, indotta da legante di calcio è stato misurato il flusso (Figura 1</stro...

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A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

L'obiettivo del presente protocollo è quello di facilitare lo studio dei recettori NMDA (NMDAR) a scala più ampia e consentire l'esame degli effetti modulatory di piccole molecole e le loro applicazioni terapeutiche.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Correlativo luce e microscopia elettronica allo Studio microgliali Interazioni con placche beta-amiloide

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...