Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
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저자는이 연구 자금에 대 한 전체 게시물 학위 학자 프로그램 사무실과 노바 티 스 연구소 생물 의학 연구에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 셀의 준비
참고:이 프로토콜을 데이터 생성을 포함 하 여 잠재 인코딩 NR1 및 NR2A 세포로 불리고 HEK293 세포를 사용 합니다.
<ol><li>HEK293 세포의 적절 한 수 씨 하 고 적절 한 최종 농도 (1.00 µ L 각)에서 NR1 / NR2A 바이러스를 추가 합니다. 384-잘 접시를 사용 하 여 10, 000 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨.</li>
	<li>또는 적절 한 휴대폰 번호와 (384-잘 접시, 10, 000 사용 하 여 셀/잘 30 µ L?...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

이 분석 결과의 성공 사용 HEK 세포의 건강에 따라 달라 집니다. 지 수 성장을 겪고 세포와 낮은 통로 번호와 함께 사용 해야 합니다. 이 분석 결과 많은 전송 고 추가 그렇게 주의 사용 하 여 솔루션의 결과에 더 높은 정확도 보장 합니다. 화합물 및 다른 모든 시 약의 농도 또한 오류를 최소화 하기 위해 크로스 체크 해야 합니다. 칼슘 유출 분석 결과 대 한 분석 결과 버퍼와 셀 미디어를 교체할 때 ?...

현재 의학의 발전, 수명 크게; 증가 했다 그러나, 그래서 나이 관련 된 질병의 유행이 하고있다. 질병 중앙 신경 조직 (CNS) 정신 분열 증, 루 경화 증 (ALS), 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 다른 사람, 사이 등의 예외가 있으며 향후 10 년간1, 증가 예상 2 , 3. N-메 틸-D-aspartate 수용 체 (NMDAR)로 알려진 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 고장 Alzheimer의 질병, 정신 분열 증, 외상 성 뇌 손상, 뇌졸중, 당뇨병, 및 보증, 녹 내장에 연결 되어있다는 효과적인, 질병 수정 요법4,5,,67의 개발에 대 한 그들의 생물학을 공부 해야 합니다.
NMDARs는 4 개의 단위체 또는 소 단위4,,89의 구성 됩니다. NMDAR의 구조 구성 뇌7,10발달 및 지역 다양성을 보여줍니다. NMDARs는 시 냅 스가 소성, 인식, 그리고 리듬의 세대에서 호흡, 운동11,,1213에서 포함 된다. 주로 휴식 막 잠재력에 비 전도성은 전압-개폐 통로 (-70 mV) 마그네슘 이온의 투과 방지에 의해 차단 됩니다. 채널 두 ligands, 조미료 및 글리신/D-떠들고의 바인딩에 의해 활성화 되 고 시 냅 스 막에 동시 도발은 AMPA 수용 체, ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 다른 서브 클래스에 의해 중재. 도발은 양이온, 특히 칼슘14,,1516의 유입 활성화 NMDAR의 마그네슘 막힘을 제거 합니다. NMDAR 활성화 세포 생존을 위해 필수적 이다, 비록 과도 한 활성화 세포 죽음17,,1819 excitotoxicity 통해 발생할 수 있습니다. 수용 체의 복잡 한 자연 뿐만 아니라 게 연구를 수행 하기 위해 도전 효과적인 치료 개발에 필요한.
다른 메서드는 NMDAR 연구 개발 되었습니다. 그러나, 각자 주의 동반 했다. 예를 들어 하나의 널리 사용 기법 항생물질을 유도할 수 있는 발기인 (Tet에)20의 통제 안정적인 셀 라인에서 세포내 칼슘에서 NMDAR 중재 변화를 측정 하는 형광 기반 분석 결과 이다. 그러나이 시스템에 필요한 ligands의 supramaximal 농도 NMDAR 억제제는 측정 중에 존재 하는 요구는 그것 경쟁 길 항 근의 활동을 검출 하기 거의 불가능. 다른 유사한 시스템에서 기능 수용 체의 식이 발생 독성, 셀 문화를 보존 하기 위해 마 취 제21,22 같은 채널 차단제를 요구 합니다. 이러한 채널 차단제는 수용 체의 코어에 앉아서 그들은 수용 체의 기능 연구 방해 플레이트 기반 포맷에 (서) 특히, 밖으로 세척 하기 어려운. 마지막으로, 패치 죄 같은 electrophysiological 측정에서 제한 된 처리량, 그리고 대규모 연구는 매우 비싼23. 도 불구 하 고, 위의 시스템은 민감한 글리신 자극; 따라서, 글리신 종속 활동은 NMDAR의 공부는 도전 된다.
여기, 우리가 NMDAR 논의 한계를 극복 하는 공부에 대 한 새로운 접근 방식을 설명 합니다. 우리의 기술은 작은 16 시간에는 소 단위의 최적의 비율로 기능 수준에서 수용 체를 표현 하는 잠재 식 시스템에 대문자로 바꿉니다. 또한, 잠재를 사용 하 여 고유 재조합 NMDAR의 광범위 한 특성을 제공 하는 간단 하 고 조합 접근 수 있습니다. 다른 분석 실험, 달리이 프로토콜은 약한 길 항 제를 사용 하는 채널 차단제를 필요 하지 않습니다. 방법의 가장 강한 장점은 약한 길 항 근의 그 후 유실, 수용 체는 글리신/D-떠들고와 조미료의 듀얼 변조 뿐만 아니라 개별 글리신 및 글루타민 산 염 바인딩 사이트의 ligand 바인딩 사이트입니다. 분석 결과 NMDAR 수용 체의 알려진된 약리학 및 그것의 알려진된 양수와 음수 변조기의 효과. 마지막으로,이 체 외에서 세포 분석 결과의 발생 과도 한 칼슘 유입으로 인 한 세포 독성을 극복 하 고 NMDAR 변조기의 발견을 가속 수 있습니다 높은 처리량 패션에 수용 체의 기능 연구에 대 한 허용 에 질병 상태.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체 (NMDAR) ionotropic 글루타민 산 염 수용 체로 분류 됩니다 있고 학습과 기억에 중요 한 역할. NMDAR 오작동, 표현으로 어느 이상-또는 아래-activity 돌연변이, 변경된 식, 인신 매매, 또는 지역화로 인 한 수많은 질병, 특히 중앙 신경 조직에에서 기여할 수 있다. 따라서, 화합물 및 작은 분자의 발견을 촉진 뿐만 아니라 이해 하는 수용 체의 생물학 신경 질환에 대처 하기 위해 지속적인 노력에서 결정적 이다. 수용 체를 공부 하 고 현재 접근 제한이 낮은 처리량, 높은 비용과 excitotoxicity NMDAR 중재를 방지 하기 위해 채널 차단제의 필요한 존재로 인해 그것의 기능적인 능력을 공부 하는 무 능력을 포함 하 여. 또한, 기존의 분석 결과 시스템만 조미료에 의해 자극에 민감한 고 글리신은 NMDAR의 다른 공동 ligand에 의해 자극 감도 부족. 여기, 선물이 공동 ligands, 조미료와 D-떠들고/글리신에 감도 NMDA 수용 체를 높은 처리량 힘을 가진 첫 번째 접시 기반 분석 결과. 이 이렇게 다른 NMDAR 소 단위 구성의 연구를 허용 하 고 글리신-또는 조미료에 민감한 모드에서 수용 체의 기능 연구를 허용. 또한, 방법 측정 동안 억제제의 존재를 필요 하지 않습니다. 이 분석 결과 함께 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기의 효과 검출 될 수 있다 고 NMDAR의 알려진된 약리학 우리의 시스템에 복제 되었습니다. 이 기술은 기존 방법의 한계를 극복 하 고 비용 효율적입니다. 우리는이 새로운 기술은 NMDAR 중재 병 리에 대 한 치료의 발견을 가속화 될 것을 믿습니다.

작은 분자의 효과 테스트 하기 전에 하나 NMDARs 최적의 ligand 농도의 최적의 식 수준을 결정 해야 합니다. 설명, HEK293 세포 384-잘 접시에 잘 당 10000 셀에서 시드 했다 5 µ M의 CGP060667, 다음 불리고 NR1 및 NR2A의 다양 한 양의 바이러스. 인큐베이션 하룻밤, ligand 유도 된 칼슘 후 유량 측정 되었다 (그림 1). 이러한 실험의 결과 공개 최고의 수량 및 각 소 단위...

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A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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파리에서 에탄올 민감도를 측정하는 간단한 방법

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

연구

신경과학

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에 타고난 및 시간주기 규제 Photobehavior을 공부하는 빛 환경의 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

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One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

높은 처리량 분석은 개인의 알을 낳는 환경 설정을 검사합니다<em&gt; 노랑 초파리</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...