Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke postkontor for programmet av Baccalaureate forskere og Novartis institutter for biomedisinsk forskning som helhet for finansiering denne studien.

1. forberedelse av celler
Merk: Denne protokollen, inkludert data generasjon, bruker HEK293 celler transduced med en baculovirus koding NR1 og NR2A celler.
<ol><li>Frø riktig antall HEK293 celler og legge NR1 og/eller NR2A viruset på riktig siste konsentrasjonen (1.00 µL hver). En 384-vel plate, bruke 10 000 celler/godt i et siste volum på 30 µL.</li>
	<li>Alternativt frø HEK293-NR1-NR2A celler i riktig celle nummer og volum (for en 384-vel plate, bruk 10 000 celler/godt i et siste vol...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

Suksessen til denne analysen avhenger i stor grad på helse HEK cellene som brukes. Cellene gjennomgår eksponentiell vekst og med lav passasje nummeret skal brukes. Denne analysen omfatter mange overføringer og tillegg av løsninger, så bruker forsiktig vil sikre høyere nøyaktighet i spørringsresultatene. Konsentrasjoner av forbindelser og alle andre bør være også kryssjekket å redusere feil. Når du erstatter cellen media med analysebuffer for kalsium flux analysen, skal platen vippes forsiktig slik at cellene...

Med gjeldende fremskritt innen medisin, har levealderen økt betydelig; men så har utbredelsen av alder-relaterte sykdommer. Sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) som schizofreni, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers og Parkinsons sykdom, blant andre, er intet unntak og har vært ventet for å øke over det neste tiår1, 2 , 3. funksjonsfeil på ionotropic glutamat reseptorer kjent som N-methyl-D-aspartate reseptorer (NMDAR) har vært knyttet til Alzheimers, schizofreni, traumatisk hjerneskade, slag, diabetes og glaukom blant annet som garanterer den trenger å studere deres biologi for utviklingen av effektive, sykdom-modifisere terapier4,5,6,7.
NMDARs består av fire4,8,9-med monomerer eller underenheter. Strukturelle sammensetningen av NMDAR viser utviklingsmessige og regionale variasjoner i hjernen7,10. NMDARs er involvert i synaptiske plastisitet, kognisjon og generering av rytmer for pust og bevegelse11,12,13. Som en spenning-gated kanal, er det i stor grad ikke-ledende på hvile membran potensial (-70 mV) og blokkeres av magnesium for å hindre ytterligere gjennomtrengning av ioner. Kanalen er aktivert ved binding av to ligander, glutamat og glysin/D-serine, og en samtidig depolarization på synaptic membranen formidlet av AMPA reseptorer, en underklasse av ionotropic glutamat reseptorer. Depolarization fjerner magnesium blokkeringen av NMDAR, slik at tilstrømningen av kasjoner, særlig kalsium14,15,16. Selv om aktivering av NMDAR er viktig for celle overlevelse, kan overdreven aktivering føre til celle død17,18,19 gjennom excitotoxicity. Dette, gjør i tillegg til den komplekse naturen reseptoren, det utfordrende for å utføre studier nødvendig for å utvikle effektive behandlinger.
Ulike metoder har blitt utviklet for å studere i NMDAR. Men har hver tilhørende begrensninger. For eksempel er en brukte teknikk en fluorescens-baserte analysen som måler NMDAR-mediert endringer i intracellulær kalsium i en stabil cellen linje under kontroll av en tetracycline-induserbart promoter (Tet-på)20. Men i dette systemet gjør supramaximal konsentrasjonen av ligander som trengs og kravet at NMDAR hemmere finnes under målingen det nesten umulig å oppdage aktivitet av konkurransedyktige antagonist. I andre lignende systemer forårsaker uttrykk for funksjonell reseptoren toksisitet, krever kanal blokkere som ketamin21,22 å bevare i cellekulturer. Disse kanal blokkere sitter ved kjernen av reseptoren og er vanskelig å vaske ut, spesielt i en plate-basert format, så de forstyrre funksjonelle studier av reseptoren. Til slutt i elektrofysiologiske målinger som oppdateringen clamping, det er begrenset kapasitet og store studier er svært dyrt23. Uansett er over systemene ufølsomme til glysin stimulering; Derfor blir studerer glycine-avhengige aktiviteten til NMDAR en utfordring.
Her beskriver vi en ny tilnærming for å studere NMDAR som overvinner diskutert begrensningene. Våre teknikk kapitaliserer på baculovirus uttrykk systemet til å uttrykke reseptoren på funksjonell nivåer med en optimal ratio på underenheter som 16 timer. Videre gir bruk av baculovirus en enkel og kombinasjon tilnærming som gir bred karakteristikk av forskjellige rekombinant NMDAR undertypene. I motsetning til andre analyser krever ikke denne protokollen kanal blokkere på grunn av bruk av svak antagonister. Metodens sterkeste fordelen er at etter bleke av svak antagonist, reseptoren er følsom for modulering av de personlige glysin og glutamat-bindende områdene i tillegg til dobbel modulering av både glysin/D-serine og glutamat ligand-bindende nettsteder. Analysen viser kjente farmakologi av NMDAR reseptoren og effekten av sine kjente positive og negative modulatorer. Til slutt denne i vitro mobilnettet analysen overvinner mobilnettet toksisitet skyldes overdreven kalsium tilstrømningen og gir funksjonell studier av reseptoren i en høy gjennomstrømming mote, som kan akselerere funn av NMDAR modulatorer i sykdom stater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer (NMDAR) er klassifisert som ionotropic glutamat reseptorer og avgjørende roller i læring og hukommelse. NMDAR feil, uttrykt som en over - eller under - activity forårsaket av mutasjoner, endret uttrykk, handel eller lokalisering, kan bidra til mange sykdommer, spesielt i sentralnervesystemet. Derfor er forstå reseptorens biologi som forbindelser og små molekyler avgjørende for pågående arbeidet med å bekjempe nevrologiske sykdommer. Gjeldende tilnærminger til å studere reseptoren har begrensninger inkludert lav overføringshastighet, høye kostnader og manglende evne til å studere sin funksjonelle egenskaper av nødvendig kanal blokkere å hindre NMDAR-mediert excitotoxicity. Dessuten de eksisterende analysen systemene er følsomme for stimulering av glutamat bare og mangler følsomhet til stimulering av glysin, andre co ligand av NMDAR. Her presenterer vi første plate-baserte analysen med høy gjennomstrømming kraft til å studere en NMDA reseptor med følsomhet for både co ligander, glutamat og D-serine/glycine. Denne tilnærmingen gir studiet av forskjellige NMDAR delenhet komposisjoner og lar funksjonelle studier av reseptoren i glycine - og/eller glutamat-sensitive moduser. I tillegg krever metoden ikke tilstedeværelse av hemmere under mål. Effekten av positive og negative allosteric modulatorer kan oppdages med denne analysen og kjent farmakologi i NMDAR har blitt kopiert i vårt system. Denne teknikken løser begrensningene for eksisterende metoder og er kostnadseffektiv. Vi tror at denne teknikken vil akselerere oppdagelsen av terapi for NMDAR-mediert patologi.

Før testing av små molekyler, må en bestemme optimale uttrykk nivåene av NMDARs samt de optimale ligand konsentrasjonene. Som beskrevet, HEK293 celler var frø på 10.000 celler per brønn i en 384-vel plate, i nærvær av 5 µM transduced CGP060667, så med varierende mengder NR1 og NR2A virus. Etter inkubasjon over natten, ligand-indusert kalsium flux ble målt (figur 1). Resultatene av disse eksperimentene avsløre beste mengden og forholdet mellom vir...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

En høy gjennomstrømming kalsium-flux analysen å studere NMDA-reseptorer med følsomhet glysin/D-serine og glutamat

Målet med denne protokollen er å forenkle studiet av NMDA-reseptorer (NMDAR) på en større skala og tillate undersøkelse av modulatory effekter av små molekyler og deres terapeutiske programmer.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lett preferanse analysen å studere medfødte og Circadian Regulert Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Utlede Tid Course of Glutamat Lagersalg med en deconvolution Analyse av astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funksjonell Avhør av Adult Hypothalamus Neurogenesis med Focal Radiologisk Hemming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic skive kulturer til å studere oligodendrocyte Dynamics og myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Høy gjennomstrømning analyse for å undersøke Eggleggingen Preferences av Individuell<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Samsvar Lys og elektronmikroskopi for å studere microglial Interaksjoner med beta-amyloid plakk

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...