Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

Författarna vill tacka de postkontor studentexamen Scholars Program och Novartis forskningsinstitut för biomedicinsk forskning som helhet för att finansiera denna studie.

1. beredning av celler
Obs: Detta protokoll, inklusive data generation, använder HEK293 celler sensorik med en baculoviridae kodning NR1 och NR2A celler.
<ol><li>Utsäde lämpliga antalet HEK293 celler och lägger den NR1 eller NR2A viruset på de lämpliga slutliga koncentrationerna (1.00 µL varje). För en plattan med 384 brunnar, använda 10 000 celler per brunn i en slutlig volym av 30 µL.</li>
	<li>Alternativt, utsäde HEK293-NR1-NR2A celler på cell lämplig antalet och volymen (fö...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

Framgången för denna analys beror på hälsan hos de HEK celler används. Celler som genomgår exponentiell tillväxt och med låg passage nummer ska användas. Denna analys innebär många överföringar och tillägg av lösningar, så använder försiktighet kommer att säkerställa högre noggrannhet i dess resultat. Koncentrationer av föreningar och alla andra reagens bör även dubbelkontrollera att minimera fel. När du ersätter cellen media med Analysbuffert för kalcium flux analysen, bör plattan lutas förs...

Med aktuella framsteg inom medicin, har medellivslängden ökat betydligt. dock så har förekomsten av åldersrelaterade sjukdomar. Sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) som schizofreni, amyotrofisk lateralskleros (ALS), Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom, bland annat är inget undantag och har varit beräknas öka under nästa årtionde1, 2 , 3. fel på jonotropa glutamatreceptorer kallas N-metyl-D-aspartat receptorer (NMDAR) har kopplats till Alzheimers sjukdom, schizofreni, traumatisk hjärnskada, stroke, diabetes och glaukom bland annat som garanterar den behöver du studera deras biologi för utvecklingen av effektiva, sjukdomsmodifierande terapier4,5,6,7.
NMDARs består av fyra monomerer eller subenheter4,8,9. NMDAR strukturella sammansättning visar utvecklingsmässiga och regionala variationer inom de hjärna7,10. NMDARs är involverade i synaptisk plasticitet, kognition och genereringen av rytmer för andning och locomotion11,12,13. Som en spänningskänsliga kanal, är det till stor del icke-dirigering vid vila membranpotential (-70 mV) och blockeras av magnesium för att förhindra ytterligare genomträngning av joner. Kanalen aktiveras av bindningen av två ligander, glutamat och glycin/D-serine, och en samtidig depolarisation på synaptiska membranet medieras av AMPA-receptorer, en annan underklass av jonotropa glutamatreceptorer. Depolarisation tar bort magnesium blockeringen av de NMDAR, möjliggör inflödet av katjoner, särskilt kalcium14,15,16. Även om aktivering av NMDAR är avgörande för cellöverlevnad, kan Överdriven aktivering leda till cell död17,18,19 genom excitotoxicitet. Detta, gör utöver den komplicerade karaktären av receptorn, det utmanande för att utföra studier behövs för att utveckla effektiva behandlingar.
Olika metoder har utvecklats för att studera NMDAR. Var och en har dock kompletterande varningar. Exempelvis är en allmänt använd teknik en fluorescens-baserad analys som mäter NMDAR-medierad förändringar i intracellulära kalcium i en stabil cellinje under kontroll av en tetracyklin-inducerbara promotor (Tet-On)20. Dock i detta system gör supramaximal koncentrationerna av ligander som behövs och kravet att NMDAR-hämmare finns under mätningen det nästan omöjligt att upptäcka aktivitet av den kompetitiv antagonisten. I andra liknande system orsakar uttrycket av den funktionella receptorn toxicitet, som kräver kalciumantagonister såsom ketamin21,22 att bevara cellkulturer. Dessa kalciumantagonister sitta kärnan i receptorn och är svåra att tvätta ur, särskilt i en tallrik-baserat format, så de stör funktionella studier av receptorn. Slutligen i elektrofysiologiska mätningar såsom patch fastspänning, det finns begränsad genomströmning och storskaliga studier är mycket dyra23. Trots är de ovan system okänslig för glycin stimulering; Därför blir studerar glycin-beroende aktivitet av NMDAR en utmaning.
Här beskriver vi en ny metod för att studera NMDAR som övervinner de diskuterade begränsningarna. Vår teknik kapitaliserar på baculoviridae uttryck systemet uttrycka receptorn på funktionella nivåer med en optimal förhållandet av subunitsna i så lite som 16 timmar. Dessutom möjliggör användningen av baculoviridae en enkel och kombinatoriska strategi, vilket ger en bred karakterisering av distinkta rekombinant NMDAR undertyper. Till skillnad från andra analyser kräver detta protokoll inte kalciumantagonister på grund av användningen av svag antagonister. Metodens starkaste fördel är att efter bortspolning av svaga antagonist, receptorn är känslig för modulering av de enskilda glycin - och glutamat-bindande platserna utöver dubbla modulering av både glycin/D-serine och glutamat ligand-bindande platser. Analysens recapitulates känd farmakologi av NMDAR-receptorn och effekterna av dess kända positiva och negativa modulatorer. Slutligen, generation av denna i vitro cellulära analys övervinner cellulär toxicitet orsakad av överdriven kalcium tillströmning och möjliggör funktionella studier av receptorn i en hög genomströmning mode, som kan accelerera upptäckter av NMDAR modulatorer vid sjukdomstillstånd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer (NMDAR) klassificeras som jonotropa glutamatreceptorer och har viktiga roller i inlärning och minne. NMDAR funktionsfel, uttryckt som antingen över - eller under - activity orsakade av mutationer, förändrad uttryck, människohandel eller lokalisering, kan bidra till många sjukdomar, särskilt i det centrala nervsystemet. Därför är förståelse receptorns biologi samt underlätta upptäckten av föreningar och små molekyler avgörande i pågående ansträngningar att bekämpa neurologiska sjukdomar. Nuvarande metoder att studera receptorn har begränsningar inklusive låg genomströmning, höga kostnader och oförmågan att studera dess funktionella förmågor på grund av kalciumantagonister nödvändigt att förhindra att NMDAR-medierad excitotoxicitet. Dessutom de befintliga systemen för analysen är känsliga för stimulering av glutamat bara och saknar känslighet för stimulering av glycin, annan samtidig liganden av NMDAR. Här presenterar vi den första plattan-baserad analysen med hög genomströmning makt att studera en NMDA-receptorn med känslighet för både Co ligander, glutamat och D-serin/glycin. Detta tillvägagångssätt kan studiet av olika NMDAR subenhet kompositioner och funktionella studier av receptorn i glycin- eller glutamat-känsliga lägen. Metoden kräver dessutom inte förekomsten av hämmare under mätningarna. Effekterna av positiva och negativa Allosteriska modulatorer kan upptäckas med denna analys och den kända farmakologin för NMDAR har replikerats i vårt system. Denna teknik övervinner begränsningarna i befintliga metoder och är kostnadseffektiv. Vi anser att denna nya teknik kommer att påskynda upptäckten av terapier för NMDAR-medierade sjukdomar.

Innan du testar effekterna av små molekyler, måste man bestämma de optimala uttrycksnivåerna för NMDARs samt optimal ligand koncentrationerna. Som beskrivits, HEK293 celler var seedad på 10 000 celler per brunn i en plattan med 384 brunnar, i närvaro av 5 µM sensorik CGP060667, sedan med varierande mängder NR1 och NR2A virus. Efter inkubering över natten, ligand-inducerad kalcium flux mättes (figur 1). Resultaten av dessa experiment avslöjar bäst...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

En hög genomströmning kalcium-flux-analysen att studera NMDA-receptorer med känslighet för glycin/D-serine och glutamat

Målet med detta protokoll är att underlätta studiet av NMDA-receptorer (NMDAR) i större skala och låta granskningen av immunmodulerande effekter av små molekyler och deras terapeutiska tillämpningar.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Ett enkelt sätt att mäta Etanol känslighet i Flugor

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Lätt preferens analys för att studera Innate och Circadian Reglerad Photobehavior i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Funktionell Förhör av Adult Hypothalamic neurogenes med Focal Radiological Hämning

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Hög genomströmning analys för att undersöka äggläggning preferenser Individuella<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Korrelat ljus- och elektronmikroskopi att studera mikroglia Interaktioner med P-amyloid plack

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...