Name: a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

Yazarlar Bakalorya bilim programı Postane ve Novartis Enstitüleri Bu çalışmada finansmanı için bir bütün olarak Biyomedikal araştırma için teşekkür etmek istiyorum.

1. hücre hazırlanması
Not: NR1 ve NR2A hücreleri kodlama bir baculovirus ile transduced HEK293 hücreleri veri üretimi, dahil olmak üzere bu protokolü kullanır.
<ol><li>HEK293 hücreler uygun sayıda tohum ve NR1 ve/veya NR2A virüs uygun son konsantrasyonları (1.00 her µL) ekleyin. 384-şey plaka için 10.000 30 µL son bir hacim içinde hücre/iyi kullanın.</li>
	<li>Alternatif olarak, tohum HEK293-NR1-NR2A hücreleri uygun cep telefonu numarasını ve birim (384-şey plaka, kul...

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

Bu tahlil başarısı büyük ölçüde kullanılan HEK hücre sağlık üzerinde bağlıdır. Hücreleri üstel büyüme geçiyor ve düşük geçiş numarası ile kullanılmalıdır. Bu tahlil birçok transferleri içerir ve eklemeler çözümleri, çok dikkatli kullanarak sonuçları daha yüksek doğruluk sağlayacaktır. Bileşikler ve diğer kimyasalları konsantrasyonları da çapraz-hatalarını en aza indirmek için kontrol olmalıdır. Böylece hücreleri değil ayırmak hücre medya kalsiyum akı tahlil için ...

Tıpta güncel gelişmeler ile yaşam süresi önemli ölçüde artmıştır; Ancak, çok yaşa bağlı hastalıkların yaygınlığı var. Şizofreni, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı, diğerleri arasında gibi merkezi sinir sistemi (MSS) hastalıkları bir istisna vardır ve sonraki on yıl1, artırmak için öngörülen 2 , 3. N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) bilinen ionotropic glutamat reseptörlerinin arıza Alzheimer hastalığı, şizofreni, travmatik beyin hasarı, felç, diyabet ve yasalar tarafından aksi gerekmekdikçe glokom diğerlerinin yanı sıra, bağlı biyolojilerinin etkili, hastalığı değiştirme tedaviler4,5,6,7gelişimi için çalışması gerekir.
NMDARs dört monomerleri veya alt birimleri4,8,9/ oluşur. NMDAR yapısal kompozisyon içinde beyin7,10gelişimsel ve bölgesel değişkenlik gösterir. NMDARs sinaptik plastisite, biliş ve ritimleri oluşturmak için nefes ve hareket11,12,13katılmaktadırlar. Voltaj bir kanal büyük ölçüde sigara-membran potansiyeli dinlenme iletken (-70 mV) ve daha fazla nüfuz iyonlar önlemek için magnezyum tarafından engellenir. Kanal iki ligandlar, glutamat ve glisin/D-serin bağlama tarafından etkinleştirilir ve sinaptik membran, eşzamanlı bir depolarizasyon AMPA reseptör, ionotropic glutamat reseptörlerinin başka bir alt sınıf tarafından aracılık. Depolarizasyon katyonlar, özellikle kalsiyum14,15,16akını etkinleştirme NMDAR, magnezyum tıkanması kaldırır. NMDAR aktivasyonu hücre hayatta kalmak için gerekli olmasına rağmen aşırı harekete geçirmek hücre ölüm17,18,-19 arası excitotoxicity yol açabilir. Bu, reseptör, karmaşık yapısı ek olarak bu çalışmaları gerçekleştirmek için zorlu etkili tedaviler geliştirmek için gerekli kılar.
NMDAR eğitim için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, her biri uyarılar eşlik vardır. Örneğin, yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri NMDAR-aracılı değişimler istikrarlı hücre kültürünü tetrasiklin-indüklenebilir organizatörü (Tet-On)20kontrol altında hücre içi kalsiyum ölçer floresans tabanlı bir tahlil olduğunu. Ancak, bu sistemde gerekli ligandlar supramaximal konsantrasyonları ve NMDAR inhibitörleri ölçüm sırasında mevcut gereksinimi yapar rekabetçi antagonist aktivite tespit etmek neredeyse imkansız. Diğer benzer sistemleri, fonksiyonel reseptör ifade toksisite, kanal blokerleri gibi hücre kültürleri korumak için ketamin21,22 gerektiren neden olur. Bu kanal blokerleri reseptör özünde oturmak ve yıkayayım, özellikle bir plaka tabanlı biçiminde, ki onlar reseptör fonksiyonel çalışmalar ile müdahale etmek zordur. Son olarak, yama sıkma gibi elektrofizyolojik ölçümlerde sınırlı işlem hacmi olduğunu ve çok pahalı23büyük ölçekli çalışmalar vardır. Rağmen yukarıdaki sistemleri glisin uyarmaya duyarsız; Bu nedenle, NMDAR glisin bağımlı etkinliği okuyan bir sorun haline gelmektedir.
Burada tartışılan sınırlamalar üstesinden NMDAR çalışmak için yeni bir yaklaşım açıklar. Bizim teknik baculovirus ifade reseptör alt birimleri en uygun bir oranı ile fonksiyonel düzeyde olduğu kadar az 16 saat içinde hızlı sisteme capitalizes. Ayrıca, geniş bir karakterizasyonu alt türlerinden farklı rekombinant NMDAR sağlayan bir basit ve kombinatorik yaklaşım için baculovirus kullanımına izin verir. Diğer deneyleri, bu iletişim kuralını zayıf antagonistleri kullanımı nedeniyle kanal blokerleri gerektirmez. Yöntemin en güçlü avantajı zayıf antagonisti sonra bu fiyasko, modülasyon bireysel glisin ve glutamat bağlama sitelerin yanı sıra çift modülasyon glisin/D-serin ve glutamat reseptör duyarlıdır-ligand taşıması siteleri. Tahlil NMDAR reseptör bilinen Farmakoloji ve bilinen onun pozitif ve negatif modülatörler etkileri beyannamedir. Son olarak, bu vitro hücresel tahlil nesil aşırı kalsiyum akını tarafından neden olduğu hücresel toksisite üstesinden gelir ve fonksiyonel çalışmalar reseptör NMDAR modülatörler keşifler hızlandırabilir yüksek üretilen iş moda sağlar hastalık durumlarında.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri (NMDAR) ionotropic glutamat reseptörlerinin sınıflandırılır ve öğrenme ve bellek önemli rollere sahiptir. NMDAR arıza olarak her iki bitti - veya altında - mutasyonlar, değiştirilmiş ifade, kaçakçılığı veya yerelleştirme, neden activity ifade, merkezi sinir sistemi özellikle çok sayıda hastalık katkıda bulunabilir. Bu nedenle, reseptör'ın biyoloji anlama hem de keşif bileşikler ve küçük moleküller kolaylaştırmak nörolojik hastalıklar ile mücadele için devam eden çabaları önemlidir. Reseptör eğitimi için geçerli yaklaşımlar iş hızı düşük, yüksek maliyet ve NMDAR-aracılı excitotoxicity önlemek için işlevsel yetenekleri kanal blokerleri gerekli varlığı nedeniyle çalışmaya yetersizlik de dahil olmak üzere bazı kısıtlamalara sahiptir. Ayrıca, varolan tahlil sistemleri stimülasyon glutamat sadece tarafından duyarlıdır ve glisin, NMDAR, diğer eş ligand stimülasyon duyarlılık eksikliği. Burada, hem eş ligandlar, glutamat ve D-serin/glisin hassasiyetle NMDA reseptör çalışmaya yüksek üretilen iş gücü ile ilk plaka tabanlı tahlil mevcut. Bu yaklaşım farklı NMDAR alt birim besteleri incelenmesi ve fonksiyonel çalışmalar reseptör glisin - ve/veya glutamat duyarlı modlarında izin verir. Ayrıca, yöntem inhibitörleri varlığı ölçümler sırasında gerektirmez. Pozitif ve negatif allosteric modülatörler etkileri bu tahlil ile tespit edilebilir ve NMDAR bilinen Farmakoloji sistemimizde çoğaltılır. Bu teknik ve varolan yöntemleri kısıtlamaları üstesinden maliyet-etkili. Biz bu roman tekniği NMDAR-aracılı patolojiler için terapiler keşfi hızlandıracak inanıyoruz.

Küçük moleküller etkileri test etmeden önce bir yanı sıra en iyi ligand konsantrasyonu NMDARs en iyi ifade düzeyleri belirlemeniz gerekir. Açıklandığı hücreleri 384-şey plaka bir kuyu başına 10.000 hücre, seribaşı HEK293 huzurunda 5 mikron CGP060667, sonra transduced değişen miktarlarda NR1 ve NR2A virüs. Kuluçka gecede, ligand kaynaklı kalsiyum sonra akı ölçüldü (Şekil 1). Bu deneylerin sonuçlarını en iyi miktar ve her alt b...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-Amyloid Plaques

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...