Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door PhRMA Stichting onderzoeksbeurs Starter en de nationale hart-, Long- en bloed Instituut van het National Institutes of Health verlenen award onder nummer R01HL138251.

1. primer ontwerp en analyse voor T7 Phage Genomic DNA
<ol><li>Het ontwerpen van inleidingen voor versterking van T7 phage genomic DNA. Opmerking: F (in voorwaartse richting) en R (omgekeerde) inleidingen (Zie Tabel van materialen) versterken de T7 DNA-sequentie ligt stroomopwaarts van de bibliotheek variabele regio (Figuur 1).</li>
	<li>Kies een geschikte primer analyzer te evalueren van de parameters van de inleidingen, waaronder smelttemperatuur (Tm), percentage GC-i...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Wij qPCR methodes om te kwantificeren van phage genomic DNA5ontwikkeld, en hier wij beschreven en aangepast van een qPCR methode om te inventariseren T7 bacteriofagen geselecteerd tegen een versperring CF-achtige slijm. Minimuminformatie voor publicatie van kwantitatieve Real-Time PCR experimenten (MIQE) richtsnoeren werden aangepast om te ontwikkelen en valideren van de methode van de qPCR opsomming van de T7 bacteriofagen15. Het protocol dat wij ontwikkeld om te kwantific...

Bacteriofaag (faag) display technologie, ontwikkeld door George Smith in 1985, is een krachtige, high-throughput benadering te identificeren van peptide of de proteïne liganden tegen doelstellingen of receptoren van het celmembraan, ziekte antigenen, cellulaire organellen of specifiek organen en weefsels in de afgelopen twee decennia1,2. Hier, willekeurige bibliotheken van polypeptiden of één keten antilichamen worden weergegeven op de vacht eiwitten van bacteriofagen (meestal M13 of T7), en specifieke liganden kunnen worden geïdentificeerd van pannen tegen geïmmobiliseerdet eiwitten in vitro of in vivo biologische systemen via een iteratieve selectietraject. Vervolgens kunnen liganden gepaard gaan met imaging of therapeutische agenten voor diagnose en behandeling van ziekten3,4. Het is van cruciaal belang om op te sommen nauwkeurig bacteriofagen tijdens meerdere stappen van biopanning: (1) te kwantificeren bacteriofagen die zich aan het substraat binden en (2) te kwantificeren bacteriofagen om te bepalen of er verrijking met elke ronde van de selectie (bacteriofaag verrijking geeft aan biopanned Phage affiniteit voor de doelgroep). De huidige gouden standaard voor kwantificering, dubbellaags plaque assay, presenteert meerdere uitdagingen; het is vervelend, omslachtige en potentieel onjuist is voor een groot aantal monsters. Daarom heeft onze fractie een gevoelige, reproduceerbaar, nauwkeurige en tijd-efficiënte kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) methode om te inventariseren M13 en T7 phage deeltjes van biopanning5ontwikkeld.
qPCR is een aantrekkelijke en haalbare methode om T7 en M13 bacteriofagen nauwkeurig te kwantificeren. Omdat elk deeltje van de individuele faag slechts één exemplaar van genomic DNA (dsDNA of ssDNA) bevatten kan, is een bacteriofaag genoom gelijk aan één phage deeltjes; door het kwantificeren van het aantal faag genomen, is het mogelijk te kwantificeren van het aantal bacteriofagen. Tijdens qPCR, fluorescerende verslaggever kleurstoffen binden genomic DNA van de bacteriofaag niet-specifiek of specifiek door middel van sequentie-specifieke primers tijdens PCR versterking, en de fluorescentie signaal verhoogt met elke ronde voor amplificatie. Wanneer het signaal van de fluorescentie bereikt de drempel, die ronde/cyclus van versterking is bekend als de drempel cyclus (Ct). De bekende concentraties van referentie phage DNA worden uitgezet tegen hun Ct-waarden om een standaard curve. Met behulp van de standaard curve met de Ct-waarden van DNA-monsters, kunnen de concentraties van bacteriofagen worden geïnterpoleerd.
Terwijl talrijke strategieën zijn eerder ontwikkeld en uitgebreid te kwantificeren bacteriofagen van biopanning gebruikt, heeft elk van hen specifieke uitdagingen. De meest populaire en conventionele methode is dubbellaags plaque assay. Hier, host bacteriën geïnfecteerd zijn met bacteriofagen voorbereid op een seriële verdunningen, op een solide agar substraat zijn verguld en zijn bedekt met agar; met het aantal plaques gevormd (dat wil zeggen, plaque vormende eenheden of pfu) op de agarplaat bacteriofagen geïnventariseerd. Plaque assay is gevoelig maar vervelend, tijdrovend en onnauwkeurig, vooral voor talloze voorbeelden en met hoge concentraties5. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zijn bovendien aangepast om op te sommen M13 en T7 phage deeltjes6,7,8. Hier, bacteriofagen in verschillende verdunningen zijn gebonden en gevangen op een stevige ondergrond (dat wil zeggen, een microplate) gesondeerd met faag-specifieke antilichamen en opgespoord door middel van verslaggevers (bijvoorbeeld enzym gevoelige chromogenic substraten, fluorophores) te Bepaal het aantal phage deeltjes aanwezig. De uitlezingen (b.v., fluorescentie, absorptie) van monsters kunnen te kwantificeren van onbekende concentraties tegen faag normen bij bekende concentraties worden gebruikt. Verschillende faag gebaseerde ELISAs zijn ontwikkeld, maar ze hebben potentiële beperkingen. Een groep ontwikkelde een papieren sandwich-ELISA met een kwantificering bereik dat omvatte zeven ordes van grootte (102-109 pfu/mL); echter, deze methode vereist meerdere stappen van antilichaam coating, kwam een hele dag voor de test-8. Onze fractie ook ontwikkelde een ELISA-methode om te kwantificeren M13 phage deeltjes maar had een minder gevoelige registratiebereik van 106  1011 pfu/mL5. Schakelbare lanthanide fluorescentie sondes zijn ontwikkeld om te inventariseren M13 en kwantificering gegevens kunnen worden verkregen binnen 20 min; Deze bepaling heeft echter een smalle dynamisch bereik van 109 tot en met 1012 pfu/mL9. Één groep atomaire kracht microscopie gebruikt om op te sommen M13 phage deeltjes in oplossing, maar dit vereist geavanceerde elektronenmicroscopie en werkte slechts binnen een smalle bandbreedte van concentraties10. Een andere studie monodispers emulsies gebruikt om val fluorescerende M13 en T4 verslaggever bacteriofagen en bacteriofagen tellen het aantal fluorescerende druppels; echter, deze aanpak ook tentoongesteld een smalle kwantificering variëren van 102 tot en met 106 pfu/mL11. Terwijl de druppel die digitale PCR te kwantificeren M13 bacteriofagen is gebruikt, is deze aanpak kunnen onderscheid maken tussen het aantal infectieuze en niet-infectieuze phage deeltjes12.
Onze fractie heeft onlangs qPCR methoden voor het inventariseren van de T7 en M13 bacteriofagen geïdentificeerd van biopanning tegen een bloed - hersenbarrière cel model met twee verschillende fluorescente verslaggever kleurstoffen5ontwikkeld. In vergelijking met voornoemde kwantificering methoden, de methoden van de qPCR we ontwikkeld waren high-throughput en tijd-efficiënte te kwantificeren van talloze voorbeelden en bekwaam om te onderscheiden tussen infectieuze en niet-infectieuze bacteriofagen met DNase ik voorbehandeling van de Phage monsters. Nog belangrijker is, deze aanpak kan reproducibly en nauwkeurig te kwantificeren M13 en T7 bacteriofagen van biopanning monsters. Begeleiden van beginnende onderzoekers op het gebied van phage qPCR, beschrijven hier we een gedetailleerde qPCR methode om te inventariseren T7 phage deeltjes uit een bibliotheek van cysteïne-beperkt (CX7C) laten draaien tegen een in vitro -barrière van het cystic fibrosis (CF)-slijm. Van dit werk, kan qPCR methode worden uitgebreid om te kwantificeren van phage deeltjes van andere soorten biopanning en uit andere bronnen, met inbegrip van water, bodem en lichaamsvloeistoffen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Dit protocol beschrijft het gebruik van kwantitatieve PCR (qPCR) om op te sommen T7 bacteriofagen van phage selectie experimenten (dat wil zeggen, "biopanning"). qPCR is een fluorescentie gebaseerde aanpak te kwantificeren van DNA, en hier, het is aangepast aan het kwantificeren van phage genomen als een proxy voor phage deeltjes. In dit protocol wordt een facile phage DNA voorbereiding methode beschreven met behulp van hoge-temperatuur verwarming zonder extra DNA zuivering. De methode moet alleen kleine volumes van warmtebehandelde bacteriofagen en kleine volumes van de reactie van de qPCR. qPCR is hoge gegevensdoorvoer en snel, kunnen verwerken en het verkrijgen van gegevens van een 96-wells-plaat van reacties in 2-4 h. vergeleken tot andere faag opsomming benaderingen, qPCR is tijd-efficiënter. Hier, wordt qPCR gebruikt om op te sommen T7 bacteriofagen geïdentificeerd van biopanning tegen in vitro cystic fibrosis-achtige slijm model. De qPCR methode kan worden uitgebreid om te kwantificeren T7 bacteriofagen uit andere experimenten, met inbegrip van andere soorten biopanning (bv., faag screening geïmmobiliseerd binding aan eiwitten, in vivo ) en andere bronnen (bijvoorbeeld watersystemen of lichaamsvloeistoffen). Kortom, kan dit protocol worden aangepast voor het kwantificeren van virussen DNA ingekapseld.

Tools voor het ontwerpen van verschillende primer kunnen worden gebruikt om qPCR inleidingen ontwerpen. Typisch, primer ontwerp programma's hebben hun eigen ingebouwde algoritmen om te berekenen en valideren van de essentiële parameters van de inleidingen, bijvoorbeeld GC %, Tm, primer dimeer of haarspeld vorming, etc. in het algemeen, de belangrijkste criteria zijn vergelijkbaar in verschillende primer ontwerptoepassingen en inleidingen kunnen worden ontworpen hun inst...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

Een reproduceerbare, accuraat en tijd efficiënt kwantitatieve PCR (qPCR) methode om op te sommen T7 bacteriofaag wordt hier beschreven. Het protocol geeft een duidelijke beschrijving van phage genomic DNA voorbereiding, PCR reactie voorbereiding, qPCR fietsen voorwaarden en qPCR data-analyse.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke problemen in de virologie en microbiologie velden in verband met de opsoming van bacteriofagen uit complexe monsters en bacteriofaag gebaseerde diagnostiek en therapieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het tijdefficiënte en nauwkeurige kwantificering van een groot aantal monsters uit faag display biopanning experimenten niet haalbaar met traditionele testen mogelijk maakt. Het aantonen van de procedure zal Rashmi Mohanty en Jasmim Leal, afgestudeerde studenten van mijn laboratorium.Na het ontwerpen van de primers en het creëren van een voorraadconcentratie, verkrijgen referentie T7 faag DNA bij een concentratie van 0,1 microgram per microliter. Met behulp van ultrazuiver water verdunnen dit DNA in serie tienvoudig, van een miljoen femtogrammen per microliter tot één femtogrammen per microliter in 0,2 milliliter PCR-buizen. Bereid 20 microliter van elke concentratie, zorg ervoor dat pipet tips en vortex de buizen tussen elke fase van de verdunning te veranderen.Zet vervolgens de T7 faagreferentie-DNA-concentratie van femtogrammen per microliter om in genoomkopieën per microliter. Ten eerste, pipet 200 microliters van het monster T7 faag kloon in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis voor elk van de 10 gewenste monsters. Voeg twee microliter DNase een aan elke buis.Dop de buizen en incubeer op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten in een verwarmd droog bad. Dan incubeer op 100 graden celsius gedurende 15 minuten in een verwarmd droog bad. Centrifugeren de buizen met de warmte behandeld fagen op 18, 534 keer g gedurende 10 seconden.Plaats de gecentrifugeerde buizen op een vortex mixer ingesteld op touch activering modus voor 10 seconden om de fagen te mengen. Draai opnieuw op 18, 534 keer g gedurende 10 seconden. Laat hierna de monsters ongeveer een uur op de laboratoriumbank liggen om ze op kamertemperatuur te koelen.Bereid de qPCR premix voor op 10 biopanned faagmonsters met onbekende concentratie en zeven monsters van standaardconcentraties in drievoud. Resulterend in een premix voor 51 monsters met 255 microliter qPCR master mix, 51 microliter primers en 102 microliter water. Aliquot acht microliters van de geprepareerde PCR mix in 51 putten van een 96-well qPCR plaat.Voeg vervolgens twee microliters van warmte behandelde T7 faagmonsters toe aan elk van deze putten, waardoor het onder het oppervlak van de qPCR premix wordt afgegeven. Verzegel de plaat met lijmfolie. Wikkel de plaat in aluminiumfolie om fluorescentiefoto bleken te minimaliseren en ga vervolgens verder met het uitvoeren van de plaat op de qPCR-apparatuur.Stel de fietsomstandigheden in en smeltcurve-instellingen zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat de qPCR is uitgevoerd, worden de versterkingsplot, smeltcurve plot, en multicomponent plot geanalyseerd uit de ruwe gegevens. De versterkingsplot geeft aan of de PCR-versterking van elk monster succesvol is of niet.De multicomponent plot vertegenwoordigt de versterking en het verval van het fluorescerende signaal gedurende de versterking cycli. Terwijl de smeltcurve plot wordt gebruikt om de specificiteit van de primers te valideren, omdat elk PCR-product heeft een unieke smelttemperatuur. De standaardcurve wordt vervolgens gegenereerd uit het referentie-DNA.Hier wordt de versterkingsefficiëntie berekend op 92,4%Representatieve gegevens uit een qPCR-studie worden vervolgens vergeleken met dezelfde faag die werden gekwantificeerd door een dubbele laag plaquetest op het geteste bereik van 10 tot 10 miljoen genoomkopieën per microliter. Zoals hier te zien is, is het aantal fagen in de qPCR-kwantificering hoger dan in de plaquetest. De herhaalbaarheid van de qPCR-methode zoals vertegenwoordigd door de coëfficiënt van variantie wordt gezien met waarden variërend van 2,85 tot 27,2%Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat er tal van overwegingen in de ontwikkeling en het gebruik van qPCR nauwkeurig kwantificeren fagen, met inbegrip van zorgvuldige behandeling en voorbereiding van monsters en kalibratie van relevante apparatuur.Volgens deze methode kunnen andere technieken worden uitgevoerd om faagdeeltjes op te sommen in een verscheidenheid van toepassingen die zijn opgenomen in vivo biopanning, faagbibliotheek DNA-voorbereiding en volgende generatie sequencing en faagdetectie in complexe milieumonsters. Vergeet niet dat fagen worden beschouwd als biologische gevaren in het laboratorium en voorzorgsmaatregelen zoals persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en labjassen, moeten altijd worden gedragen tijdens het uitvoeren van de procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Ontwikkeling en validatie van een kwantitatieve PCR-methode voor equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypering van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Door Ribosomaal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolatie en kwantitatieve evaluatie van de penseel cellen van muis Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-Lyssavirus real time RT-PCR voor rabiës diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Bepaling van immuuncelidentiteit en zuiverheid Met behulp van epigenetische kwantitatieve PCR

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...