Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par PhRMA subvention de la Fondation recherche Starter et le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health octroyer sous attribution numéro R01HL138251.

1. amorce conception et analyse de l’ADN génomique Phage T7
<ol><li>Conception des amorces pour l’amplification de l’ADN génomique de phage T7. NOTE : F (avec impatience) et amorces de R (marche arrière) (voir la Table des matières) amplifient la séquence d’ADN T7 située en amont de la région variable de bibliothèque (Figure 1).</li>
	<li>Choisir un analyseur d’apprêt approprié pour évaluer les paramètres des amorces, y compris la température de ...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. 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S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. 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R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. 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A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Nous avons développé des méthodes de qPCR pour quantifier le phage d’ADN génomique5, et ici nous avons décrit et adapté une méthode de qPCR pour énumérer les phages T7 sélectionnés contre une barrière de type CF glaire. Minimum d’informations pour connaître les instructions Publication de Quantitative Real-time PCR expériences (MIQE) ont été adaptés afin de développer et de valider la méthode de qPCR pour dénombrement des phages de T715. Le protocole...

Technologie d’affichage bactériophage (phage), mis au point par George Smith en 1985, est une approche puissante et à haut débit afin d’identifier des ligands peptidiques ou de protéines contre des cibles ou des récepteurs de la membrane cellulaire, les antigènes de la, les organites cellulaires ou spécifiques organes et tissus dans les dernières deux décennies1,2. Ici, les librairies aléatoires des polypeptides ou des anticorps de la seule chaîne sont affichées sur les protéines de manteau de phages (typiquement M13 ou T7) et des ligands spécifiques peuvent être identifiés de panoramique contre les protéines immobilisées in vitro ou in vivo systèmes biologiques à travers un processus itératif de sélection. Puis, les ligands peuvent être couplés avec des agents d’imagerie ou thérapeutiques pour le diagnostic et le traitement des maladies3,4. Il est essentiel d’énumérer avec précision les phages pendant plusieurs étapes de protéines : (1) pour quantifier les phages qui se lient au substrat et (2) pour quantifier les phages pour déterminer s’il y a enrichissement avec chaque tour de sélection (enrichissement du phage indique biopanned affinité du phage pour la cible). L’étalon-or actuel pour la quantification, essai de plaque double-couche, présente plusieurs défis ; C’est fastidieux, lourd et potentiellement inexacts pour un grand nombre d’échantillons. Par conséquent, notre groupe a développé une méthode de réaction en chaîne (qPCR) de polymérase quantitative sensible, reproductible, précises et économes en temps pour énumérer des particules de protéines5bactériophages M13 et T7.
qPCR est une méthode attrayante et faisable de quantifier avec précision les phages T7 et M13. Étant donné que chaque particule individuelle phage ne peut contenir qu’une seule copie de l’ADN génomique (dsDNA ou ADN simple brin), un génome phagique équivaut à une particule de phage ; en quantifiant le nombre de génomes de phage, il est possible de quantifier le nombre de phages. Au cours de qPCR, journaliste fluorescent colorants lient l’ADN génomique de phage non spécifique ou plus précisément par les amorces spécifiques de séquence au cours de l’amplification par PCR et la fluorescence signal augmente avec chaque tour d’amplification. Lorsque le signal de fluorescence atteint le seuil, ronde/cycle d’amplification est remarqué que le cycle seuil (Ct). Les concentrations connues du phage référence ADN sont tracées contre leurs valeurs de Ct pour tracer une courbe d’étalonnage. À l’aide de la courbe d’étalonnage avec les valeurs de Ct d’échantillons d’ADN, les concentrations de phages peuvent être interpolées.
Alors que de nombreuses stratégies ont été développées précédemment et largement utilisés pour quantifier les phages de criblage, chacun d’eux a des défis particuliers. Méthode la plus populaire et traditionnelle est double couche plaque de dosage. Ici, les hôtes de bactéries sont infectés par des phages préparés à des dilutions successives, sont cultivées sur un substrat solide agar et sont recouvertes d’agar ; les phages sont énumérés avec le nombre de plaques formées (i.e., unités formant des plaques ou pfu) sur la gélose. Essai de plaque est sensible mais fastidieux, chronophage et imprécise, surtout pour les nombreux échantillons et avec des concentrations élevées de5. En outre, les dosages immuno-enzymatiques (ELISA) ont été adaptés pour énumérer les M13 et T7 phage particules6,7,8. Ici, les phages à différentes dilutions sont liés et capturé sur un substrat solide (c.-à-d. une microplaque), hybridés avec des anticorps spécifiques phage et détectés en utilisant des reporters (p. ex., enzyme sensible substrats chromogènes, fluorophores) à déterminer le nombre de particules phagiques présents. Les afficheurs (p. ex., fluorescence, absorbance) des échantillons peuvent être utilisés pour quantifier les concentrations inconnues contre normes phage à des concentrations connues. Différents tests ELISA axée sur les phages ont été développées, mais ils ont limites potentielles. Un groupe a élaboré un sandwich ELISA, sur papier, avec une gamme de quantification qui a duré sept ordres de grandeur (2-10 109 UFP/mL) ; Cependant, cette méthode requise plusieurs étapes du revêtement de l’anticorps et a pris pour une journée entière pour le dosage de8. Notre groupe a également mis au point une méthode ELISA pour quantifier les particules phagiques M13 mais avait une portée de détection moins sensible de 106 à 1011 UFP/mL5. Lanthanide commutable fluorescence sondes ont été développés pour énumérer des M13 et données de quantification peuvent être obtenues dans les 20 min ; Toutefois, ce test a une étroite plage dynamique de 109 1012 UFP/mL9. Un groupe utilisé microscopie à force atomique pour énumérer les particules phagiques M13 en solution, mais cela requiert la microscopie électronique avancée et ne fonctionnait que dans une fourchette étroite de concentrations10. Une autre étude utilisé monodispersés émulsions pour piéger les phages de journaliste M13 et T4 fluorescents et compter les phages par le nombre de gouttelettes fluorescents ; Cependant, cette approche présentait également une gamme étroite de quantification de 102 106 UFP/mL11. Tout en gouttelettes que numérique PCR a été utilisée pour quantifier les phages M13, cette approche ne peut pas faire la différence entre le nombre de particules infectieuses et non-infectieuses phage12.
Notre groupe a récemment mis au point des méthodes de qPCR pour énumérer des phages T7 et M13 identifiés de criblage contre un modèle de barrière hémato - encéphalique cellulaire à l’aide de deux journaliste fluorescents différents colorants5. Par rapport aux méthodes de quantification susmentionnés, les méthodes de qPCR, nous avons développé étaient haut débit et temps-efficace pour quantifier les nombreux échantillons et capable de différencier les phages infectieux et non infectieux à la DNase I avant le traitement de la échantillons de phages. Ce qui est important, cette approche peut reproductible et précisément quantifier des bactériophages M13 et T7 dans des échantillons de protéines. Pour guider les chercheurs débutants dans le domaine du phage qPCR, nous décrivons ici une méthode détaillée de qPCR pour énumérer des particules de phage T7 auprès d’une bibliothèque sont limitées cystéine (CX7C) batées contre une barrière de mucus in vitro la fibrose kystique (FK). De ce travail, qPCR méthode peut être étendue pour quantifier les particules phagiques depuis d’autres types de protéines et d’autres sources, y compris l’eau, le sol et les fluides de corps.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Ce protocole décrit l’utilisation de la PCR quantitative (qPCR) pour énumérer les phages T7 d’expériences de sélection phage (c'est-à-dire, « biopanning »). qPCR est une approche axée sur la fluorescence pour quantifier l’ADN, et ici, il est adapté pour quantifier les génomes phagiques comme une approximation des particules phagiques. Dans le présent protocole, un procédé de préparation d’ADN de phage facile est décrite à l’aide de chauffage haute température sans purification d’ADN supplémentaire. La méthode n’a besoin que de petites quantités de phages traité thermiquement et de petits volumes de la réaction de qPCR. qPCR est haut débit et rapide, capable de traiter et d’obtenir des données d’une plaque à 96 puits de réactions en 2 à 4 h. par rapport aux autres approches d’énumération phage, qPCR soit le plus court possible. Ici, qPCR est utilisée pour énumérer les phages T7 identifiés de criblage contre modèle in vitro de mucus comme la fibrose kystique. La méthode de qPCR peut être étendue pour quantifier les phages T7 d’autres expériences, y compris d’autres types de protéines (p. ex.., dépistage de phage immobilisé la liaison aux protéines, in vivo ) et d’autres sources (par exemple, les systèmes de l’eau ou des liquides organiques). En résumé, ce protocole peut être modifié afin de quantifier des virus à ADN-encapsulé.

Outils de conception d’amorce différents permet de concevoir des amorces de qPCR. En général, amorces programmes ont leurs propres algorithmes intégrés pour calculer et valider les paramètres clés des amorces, par exemple, GC %, Tm, dimère d’amorce ou formation en épingle à cheveux, etc. en général, les principaux critères sont similaires dans les différents outils de conception d’amorce et amorces peuvent être conçus en suivant leurs instructions. ...

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Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR quantitative du bactériophage T7 de criblage

Reproductible, précise et temps efficace quantitative PCR (qPCR) décrit une méthode pour énumérer bactériophage T7 est ici. Le protocole décrit clairement la préparation d’ADN génomique de phage, préparation de réaction PCR, qPCR conditions cyclisme et analyse de données de qPCR.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Cette méthode pourrait aider à résoudre les problèmes clés dans les domaines de la virologie et de la microbiologie liés à l’énumération des bactériophages à partir d’échantillons complexes et de diagnostics et thérapeutiques à base de bactériophage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une quantification efficace et précise du temps d’un grand nombre d’échantillons provenant d’expériences de biopannage d’affichage de phages qui ne sont pas réalisables avec les essais traditionnels. Rashmi Mohanty et Jasmim Leal, étudiants diplômés de mon laboratoire, démontreront la procédure.Après avoir conçu les amorces et créé une concentration de stock, obtenir l’ADN de phage T7 de référence à une concentration de 0,1 microgramme par microlitre. En utilisant de l’eau ultrapure, diluer en série cet ADN décuplé, d’un million de femtogrammes par microlitre à un femtogramme par microlitre dans des tubes PCR de 0,2 millilitre. Préparer 20 microlitres de chaque concentration, en s’assurant de changer les pointes de pipette et vortex les tubes entre chaque étape de la dilution.Ensuite, convertir la concentration d’ADN de référence t7 phage des femtogrammes par microlitre en copies du génome par microlitre. Tout d’abord, pipette 200 microlitres du clone de phage T7 échantillon dans un tube de centrifugeuse micro de 1,5 millilitre pour chacun des 10 échantillons désirés. Ajouter deux microlitres de DNase un à chaque tube.Capez les tubes et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain sec chauffé. Puis incuber à 100 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bain sec chauffé. Centrifugeuse les tubes contenant les phages traités à la chaleur à 18, 534 fois g pendant 10 secondes.Placez les tubes centrifugés sur un mélangeur vortex réglé en mode activation tactile pendant 10 secondes pour mélanger les phages. Tournez à nouveau à 18, 534 fois g pendant 10 secondes. Après cela, laissez les échantillons sur le banc de laboratoire environ une heure pour les refroidir à température ambiante.Préparer le prémémix qPCR pour 10 échantillons de phages biopannés de concentration inconnue et sept échantillons de concentrations standard en triplicate. Résultant en un prémétrage pour 51 échantillons contenant 255 microlitres de mélange principal qPCR, 51 microlitres d’amorces et 102 microlitres d’eau. Aliquot huit microlitres du mélange PCR préparé en 51 puits d’une plaque qPCR de 96 puits.Ajoutez ensuite deux microlitres d’échantillons de phages T7 traités à la chaleur à chacun de ces puits, en les distribuant sous la surface du prémémix qPCR. À l’aide d’un film adhésif, sceller la plaque. Envelopper la plaque dans du papier d’aluminium pour minimiser le blanchiment des photos de fluorescence, puis procéder à l’utilisation de la plaque sur l’équipement qPCR.Configurer les conditions de cycle et les paramètres de la courbe de fusion tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Une fois le qPCR exécuté, la parcelle d’amplification, la parcelle de courbe de fusion et la parcelle multicomposante sont analysées à partir des données brutes. La parcelle d’amplification indique si l’amplification PCR de chaque échantillon est réussie ou non.La parcelle multicomposante représente l’amplification et la décomposition du signal fluorescent tout au long des cycles d’amplification. Alors que la parcelle de courbe de fusion est utilisée pour valider la spécificité des amorces, puisque chaque produit PCR a une température de fusion unique. La courbe standard est ensuite générée à partir de l’ADN de référence.Ici, l’efficacité de l’amplification est calculée à 92,4% Les données représentatives d’une étude qPCR sont ensuite comparées au même phage qui ont été quantifiés par un essai de plaque à double couche à la gamme testée de 10 à 10 millions d’exemplaires du génome par microlitre. Comme on le voit ici, le nombre de phages dans la quantitation qPCR est plus élevé que dans l’analyse de plaque. La répétabilité de la méthode qPCR telle que représentée par le coefficient de variance est considérée comme avoir des valeurs allant de 2,85 à 27,2%Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il existe de nombreuses considérations dans le développement et l’utilisation de qPCR pour quantifier avec précision les phages, y compris le traitement soigneux et la préparation des échantillons et l’étalonnage de l’équipement pertinent.Suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être réalisées afin d’énumérer les particules de phage dans une variété d’applications incluses dans le biopannage vivo, la préparation de l’ADN de la bibliothèque de phages et la détection de séquençage et de phage de prochaine génération dans des échantillons environnementaux complexes. N’oubliez pas que les phages sont considérés comme des dangers biologiques en laboratoire et que les précautions telles que l’équipement de protection individuelle, y compris les gants et les blouses de laboratoire, doivent toujours être portées pendant l’exécution de la procédure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

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Recherche

Immunologie et infection

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Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

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Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

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