Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von PhRMA Stiftung Forschungsstipendium Starter unterstützt und das National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unter prämiennummer R01HL138251 gewähren.

(1) besser gekleideteres Design und Analyse für T7 Phagen genomischer DNA
<ol><li>Primer für die Amplifikation der T7 Phagen genomischer DNA zu entwerfen. Hinweis: F (vorwärts) und R (rückwärts) Primer (siehe Tabelle der Materialien) verstärken die T7 DNA-Sequenz befindet sich oberhalb der Bibliothek Variable Region (Abbildung 1).</li>
	<li>Wählen Sie einen geeignete Grundierung-Analysator, Parameter der Primer, einschließlich Schmelztemperatur (Tm), prozentuale...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Wir qPCR-Methoden zur Quantifizierung von genomische DNA-Phagen5entwickelt, und wir hier beschrieben und eine qPCR-Methode zum Auflisten der T7 Phagen gewählt gegen eine CF-wie Schleim-Barriere angepasst. Mindestangaben für die Veröffentlichung der Quantitative Real-Time PCR Experimente (MIQE) Leitlinien wurden angepasst, um Entwicklung und Validierung der qPCR-Methode für die Enumeration von T7 Phagen15. Das Protokoll, die wir entwickelt, um die Phagen aus Biopanning E...

Bakteriophagen (Phagen)-Display-Technologie, entwickelt von George Smith 1985 ist ein leistungsfähiges, Hochdurchsatz-Ansatz Peptid oder Protein Liganden gegen Ziele oder Rezeptoren von der Zellmembran, Krankheit Antigene, zellulare Organellen oder spezifische identifizieren Organe und Gewebe in den vergangenen zwei Jahrzehnten1,2. Hier zufällige Bibliotheken der Polypeptide oder einzelne Kette Antikörper auf die Hüllproteine des Phagen (in der Regel M13 oder T7) angezeigt werden, und spezifische Liganden identifiziert werden, von panning gegen immobilisierten Proteine in Vitro oder in vivo biologischen Systemen durch einen iterativen Auswahlprozess. Dann können die Liganden mit bildgebenden oder therapeutischen Wirkstoffen für Diagnose und Behandlung von Krankheiten3,4gekoppelt werden. Ist es wichtig, genau Auflisten von Phagen in mehrere Stufen der Biopanning: (1), Phagen zu quantifizieren, die an das Substrat gebunden und (2) zu quantifizieren Phagen um festzustellen, ob Anreicherung mit jeder Runde Auswahl (Phagen Anreicherung zeigt Biopanned Phagen-Affinität für das Ziel). Der derzeitige Goldstandard für Quantifizierung, Doppelschicht-Plaque-Assay, Herausforderungen mehrere; Es ist langwierig, umständlich und möglicherweise ungenau für eine große Anzahl von Proben. Daher hat unsere Fraktion eine sensible, reproduzierbare, präzise und zeitsparend quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Methode, um M13 und T7 Phagen Partikel aus Biopanning5aufzählen entwickelt.
qPCR ist eine attraktive und machbare Methode, T7 und M13 Phagen genau zu quantifizieren. Da jedes einzelnen Phagen Partikel nur eine Kopie der genomischen DNA (DsDNA oder SsDNA) enthalten kann, entspricht einem Phagen-Genom ein Phagen Partikel; durch die Zahl der Phagen Genome zu quantifizieren, ist es möglich, die Zahl der Phagen zu quantifizieren. Während qPCR, fluoreszierende Reporter Farbstoffe binden Phagen genomischer DNA unspezifisch oder speziell durch Sequenz-spezifische Primer während PCR Verstärkung und die Fluoreszenz Signal erhöht sich mit jeder Runde der Verstärkung. Wenn das Fluoreszenzsignal erreicht die Schwelle, die Runde/Zyklus der Verstärkung wird als der Schwellenwert-Zyklus (Ct) vermerkt. Die bekannten Konzentrationen von Referenz-Phagen DNA werden gegen ihre Ct-Werte herstellen eine Standardkurve geplottet. Mit der Ct-Werte von DNA-Proben der Standardkurve, können die Konzentrationen von Phagen interpoliert werden.
Während zahlreiche Strategien wurden zuvor entwickelt und intensiv genutzt, um Phagen aus Biopanning zu quantifizieren, hat jeder von ihnen spezifischen Herausforderungen. Die beliebtesten und konventionelle Methode ist Doppelschicht-Plaque-Assay. Hier, Host Bakterien mit Phagen vorbereitet in Verdünnungsreihen infiziert sind, sind auf einem festen Nährboden Substrat beschichtet und werden mit Agar überlagert; Phagen sind mit der Anzahl von Plaques gebildet (d. h. Plaque bildende Einheiten oder Pfu) auf der Agarplatte aufgezählt. Plaque-Assay ist sensibel aber mühsam, zeitaufwendig und ungenau, vor allem für zahlreiche Proben und mit hohen Konzentrationen5. Darüber hinaus wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) M13 und T7 Phagen Partikel6,7,8aufzählen angepasst. Hier werden Phagen bei verschiedenen Verdünnungen gebunden und auf ein festes Substrat (d. h. einer Mikrotestplatte) gebannt, sondiert mit Phagen-spezifische Antikörper und mithilfe von Reportern (z. B. Enzym empfindliche chromogene Substrate, Fluorophore) erkannt bestimmen Sie die Anzahl der Phagen Partikel vorhanden. Die anzeigen (z. B. Fluoreszenz, Absorption) der Proben können verwendet werden, zu unbekannte Konzentrationen gegen Phagen Standards bei bekannten Konzentrationen zu quantifizieren. Verschiedenen Phagen-basierte ELISAs entwickelt worden, aber sie haben mögliche Einschränkungen. Eine Gruppe entwickelte eine Papier-basierten Sandwich ELISA mit einer Quantifizierung-Palette, die überspannte sieben Größenordnungen (102-109 Pfu/mL); jedoch diese Methode erforderte mehrere Schritte der Antikörper-Beschichtung und dauerte bis einen ganzen Tag für den Assay-8. Unsere Fraktion auch entwickelt eine ELISA-Methode zur Quantifizierung der M13 Phagen Partikel aber hatte ein unempfindlicher Erfassungsbereich 106 bis 1011 Pfu/mL5. Schaltbare lanthanid Fluoreszenz Sonden wurden entwickelt, um M13 aufzählen und Quantifizierung Daten innerhalb von 20 min gewonnen werden; Dieser Test hat jedoch einen engen Dynamikbereich von 109 1012 Pfu/mL9. Eine Gruppe verwendet Rasterkraftmikroskopie M13 Phagen Partikel in Lösung aufzählen, aber dies erfordert erweiterte Elektronenmikroskopie und funktionierte nur in einem engen Bereich von Konzentrationen10. Eine weitere Studie zur trap fluoreszierender M13 und T4 Reporter Phagen und Phagen zählen, indem Sie die Anzahl der fluoreszierenden Tröpfchen Monodisperse Emulsionen; jedoch stellte dieser Ansatz auch eine schmale Quantifizierung reichen von 102 bis 106 Pfu/mL11. Während Tröpfchen, die digitale PCR verwendet wurde, um M13 Phagen zu quantifizieren, ist dieser Ansatz nicht in der Lage, zwischen der Anzahl der infektiösen und nicht infektiösen Phagen Partikel12zu unterscheiden.
Unsere Gruppe hat vor kurzem qPCR Methoden zum Auflisten von T7 und M13 Phagen aus Biopanning gegen ein Blut - Hirn-Schranke-Zelle-Modell mit zwei verschiedenen fluoreszierenden Reporter Farbstoffe5identifiziert entwickelt. Im Vergleich zu oben genannten Quantifizierungsmethoden, qPCR-Methoden, die wir entwickelt wurden Hochdurchsatz- und zeiteffizient zu zahlreichen Proben zu quantifizieren und in der Lage zu differenzieren zwischen infektiösen und nicht infektiösen Phagen mit DNase ich Vorbehandlung von der Phagen Proben. Wichtig ist, kann dieser Ansatz reproduzierbar und präzise M13 und T7 Bakteriophagen von Biopanning Proben quantifizieren. Um Anfänger Forscher auf dem Gebiet des Phagen qPCR zu leiten, beschreiben wir hier eine detaillierte qPCR-Methode, um T7 Phagen Partikel aus einer Cystein eingeschränkt Bibliothek (CX7C) gegen eine in-vitro- zystische Fibrose (CF) Schleim Barriere verrissen aufzählen. Aus dieser Arbeit kann qPCR-Methode erweitert werden um Phagen Partikel aus anderen Arten von Biopanning und aus anderen Quellen, einschließlich Wasser, Boden und Körperflüssigkeiten zu quantifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von quantitativen PCR (qPCR) aufzuzählenden Phagen T7 von Phagen Auswahl Experimente (z.B. "Biopanning"). qPCR ist eine Fluoreszenz basierenden Ansatz, DNA zu quantifizieren, und es hier angepasst, Phagen Genome als Proxy für den Phagen Partikel zu quantifizieren. In diesem Protokoll wird eine einfache Phagen DNA Vorbereitung Methode beschrieben mit Hochtemperatur-Heizung ohne zusätzliche DNA-Reinigung. Die Methode benötigt nur kleine Mengen an wärmebehandelten Phagen und Kleinmengen der qPCR Reaktion. qPCR ist Hochdurchsatz- und schnell, in der Lage, zu verarbeiten und erhalten Daten von einer 96-Well-Platte von Reaktionen im 2 – 4 h im Vergleich zu anderen Ansätzen Phagen-Enumeration, qPCR ist Zeit effizienter. Hier dient der qPCR aufzuzählenden T7 Phagen aus Biopanning gegen in-vitro- Mukoviszidose-artigen Schleim Modell identifiziert. Die qPCR-Methode kann ausgedehnt werden um Phagen T7 aus anderen Experimenten, einschließlich andere Arten von Biopanning zu quantifizieren (zB., immobilisiert Proteinbindung, in-vivo -Phagen-Screening) und anderen Quellen (z. B. Wasser-Systeme oder Körperflüssigkeiten). Zusammenfassend kann dieses Protokoll geändert werden, um DNA-gekapselte Viren quantifizieren.

Verschiedene Primer-Design-Tools lässt sich qPCR Primer zu entwerfen. In der Regel ähneln besser gekleideteres Design Programme haben ihre eigenen eingebauten Algorithmen berechnen und validieren die Schlüsselparameter für die Grundierungen, z. B. GC %, Tm, Grundierung Dimer oder Haarnadel Bildung usw. in der Regel, die wichtigsten Kriterien in verschiedenen Grundierung-Design-Tools und Primer ist gestaltbar nach ihren Anweisungen. Grundierung BLAST kann verwendet we...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

Eine reproduzierbare und genaue Zeit effizientere quantitative PCR (qPCR) Methode aufzuzählenden T7 Bakteriophagen wird hier beschrieben. Das Protokoll beschreibt klar Phagen genomische DNA-Vorbereitung, PCR Reaktion Vorbereitung, qPCR Radsport Bedingungen und qPCR Datenanalyse.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Diese Methode könnte helfen, Schlüsselprobleme in den Bereichen Virologie und Mikrobiologie im Zusammenhang mit der Aufzählung von Bakteriophagen aus komplexen Proben und Bakteriophagen basierenden Diagnostiken und Therapeutika zu lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine zeiteffiziente und genaue Quantifizierung einer großen Anzahl von Proben aus Phagen-Display-Biopanning-Experimenten ermöglicht, die mit herkömmlichen Assays nicht möglich sind. Demonstriert wird das Verfahren von Rashmi Mohanty und Jasmim Leal, Absolventen meines Labors.Nach dem Entwerfen der Primer und der Erstellung einer Lagerkonzentration erhalten Sie Referenz T7 Phagen-DNA in einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter. Mit Reinstwasser verdünnen Sie diese DNA seriell verzehnfacht, von einer Million Femtogrammen pro Mikroliter auf ein Femtogramm pro Mikroliter in 0,2 Milliliter PCR-Röhren. Bereiten Sie 20 Mikroliter jeder Konzentration vor, stellen Sie sicher, dass Diepipe-Spitzen und Wirbel der Rohre zwischen jeder Stufe der Verdünnung zu ändern.Konvertieren Sie dann die DNA-Konzentration des T7-Phagens von Femtogrammen pro Mikroliter in Genomkopien pro Mikroliter. Zuerst Pipette 200 Mikroliter der Probe T7 Phagen Klon in eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jede der 10 gewünschten Proben. Fügen Sie zwei Mikroliter DNase zu jeder Röhre hinzu.Die Rohre kappen und 10 Minuten lang in einem beheizten Trockenbad bei 37 Grad Celsius bebrüten. Dann bei 100 Grad Celsius für 15 Minuten in einem beheizten Trockenbad bebrüten. Zentrifugieren Sie die Rohre, die die wärmebehandelten Phagen bei 18, 534 mal g für 10 Sekunden enthalten.Legen Sie die Zentrifugenrohre 10 Sekunden lang auf einen Wirbelmischer im Touch-Aktivierungsmodus, um die Phagen zu mischen. Drehen Sie wieder bei 18, 534 mal g für 10 Sekunden. Danach lassen Sie die Proben etwa eine Stunde auf der Laborbank, um sie auf Raumtemperatur abzukühlen.Bereiten Sie den qPCR-Premix für 10 biopanierte Phagenproben unbekannter Konzentration und sieben Proben von Standardkonzentrationen in Dreifachen vor. Daraus ergibt sich ein Vormix für 51 Proben mit 255 MikroliterqPCR-Master-Mix, 51 Mikroliter Primer und 102 Mikroliter Wasser. Aliquot acht Mikroliter der vorbereiteten PCR mischen in 51 Brunnen einer 96-Well qPCR Platte.Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter wärmebehandelten T7-Phagenproben zu jedem dieser Brunnen hinzu und geben sie unter der Oberfläche des qPCR-Vormixes ab. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie. Wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie, um fluoreszenz-Fotobleichungen zu minimieren, und fahren Sie dann mit dem Ausführen der Platte auf dem qPCR-Gerät fort.Richten Sie die Zyklusbedingungen und Schmelzkurveneinstellungen wie im Textprotokoll beschrieben ein. Nachdem die qPCR ausgeführt wurde, werden das Amplifikationsdiagramm, das Schmelzkurvendiagramm und das Mehrkomponentendiagramm aus den Rohdaten analysiert. Das Amplifikationsdiagramm gibt an, ob die PCR-Verstärkung jeder Probe erfolgreich ist oder nicht.Das Mehrkomponentendiagramm stellt die Verstärkung und den Zerfall des Fluoreszenzsignals während der Amplifikationszyklen dar. Während das Schmelzkurvendiagramm verwendet wird, um die Spezifität der Primer zu validieren, da jedes PCR-Produkt eine einzigartige Schmelztemperatur hat. Die Standardkurve wird dann aus der Referenz-DNA generiert.Hier wird die Amplifikationseffizienz auf 92,4% berechnet. Wie hier zu sehen, ist die Anzahl der Phagen in der qPCR-Quantifizierung höher als im Plaque-Assay. Die Wiederholbarkeit der qPCR-Methode, dargestellt durch den Varianzkoeffizienten, hat Werte zwischen 2,85 und 27,2%Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es zahlreiche Überlegungen bei der Entwicklung und Verwendung von qPCR gibt, um Phagen genau zu quantifizieren, einschließlich sorgfältiger Behandlung und Vorbereitung von Proben und Kalibrierung relevanter Geräte.Nach dieser Methode können andere Techniken durchgeführt werden, um Phagenpartikel in einer Vielzahl von Anwendungen aufzuzählen, die in vivo Biopanning, Phagenbibliotheks-DNA-Vorbereitung und Sequenzierung und Phagendetektion der nächsten Generation in komplexen Umweltproben enthalten sind. Vergessen Sie nicht, dass Phagen als biologische Gefahren im Labor betrachtet werden und Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Labormäntel, sollten immer während der Durchführung des Verfahrens getragen werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolierung und quantitative Auswertung von Bürstenzellen von Maustracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit mittels epigenetischer quantitativer PCR

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...