Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

यह काम PhRMA फाउंडेशन रिसर्च स्टार्टर अनुदान और राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों के रक्त संस्थान पुरस्कार संख्या R01HL138251 के तहत द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. T7 फेज जीनोमिक डीएनए के लिए प्राइमर डिजाइन और विश्लेषण
<ol><li>डिजाइन T7 फेज जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन के लिए प्राइमर । नोट: एफ (आगे) और आर (रिवर्स) प्राइमर ( सामग्री की तालिकादेखें) T7 डीएनए अनुक्रम बढ़ा?...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

हम विकसित qPCR तरीके फेज जीनोमिक डीएनए यों तो5, और यहां हम वर्णित है और एक qPCR विधि T7 phages एक CF-बलगम की तरह बाधा के खिलाफ चयनित गणना करने के लिए अनुकूलित । मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर प्रयोगों (MIQE) दिशानिर...

भोजी (फेज) प्रदर्शन प्रौद्योगिकी, १९८५ में जॉर्ज स्मिथ द्वारा विकसित की है, एक शक्तिशाली, उच्च प्रवाह दृष्टिकोण के लक्ष्य या कोशिका झिल्ली, रोग एंटीजन, सेलुलर organelles या विशिष्ट से रिसेप्टर्स के खिलाफ पेप्टाइड या प्रोटीन लाइगैंडों की पहचान है अंगों और ऊतकों पिछले दो दशकों में1,2. यहां, polypeptides या एकल चेन एंटीबॉडी के यादृच्छिक पुस्तकालयों phages (आमतौर पर M13 या T7) के कोट प्रोटीन पर प्रदर्शित कर रहे हैं, और विशिष्ट लाइगैंडों इन विट्रो में या vivo में मैटीरियल प्रोटीन के खिलाफ panning से पहचाना जा सकता है एक चलने चयन प्रक्रिया के माध्यम से जैविक प्रणालियों । फिर, लाइगैंडों3,4रोगों के निदान और उपचार के लिए इमेजिंग या चिकित्सकीय एजेंटों के साथ युग्मित किया जा सकता है । यह सही है की गणना करने के लिए phages के कई चरणों के दौरान सटीक: (1) सब्सट्रेट करने के लिए बाइंड करने के लिए phages है और (2) phages यों तो चयन के प्रत्येक दौर के साथ संवर्धन है निर्धारित करने के लिए (फेज संवर्धन panned इंगित करता है लक्ष्य के लिए फेज अपनत्व) । ठहराव, डबल परत पट्टिका परख के लिए वर्तमान सोने के मानक, कई चुनौतियां प्रस्तुत करता है; यह थकाऊ, बोझिल है, और संभावित नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए गलत है । इसलिए, हमारे समूह ने एक संवेदनशील, reproducible, सटीक और समय कुशल मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विधि विकसित की है M13 और T75panning से फेज कणों की गणना करने के लिए ।
qPCR एक आकर्षक और व्यवहार्य विधि को सही मात्रा T7 और M13 phages है । के बाद से प्रत्येक व्यक्ति फेज कण केवल जीनोमिक डीएनए (dsDNA या ssDNA) की एक प्रति शामिल कर सकते हैं, एक फेज जीनोम एक फेज कण के बराबर है; फेज जीनोम की संख्या को बढ़ाता द्वारा, यह phages की संख्या यों तो संभव है । qPCR के दौरान, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर रंजक फेज जीनोमिक डीएनए गैर विशेष रूप से या विशेष रूप से अनुक्रम के माध्यम से, पीसीआर प्रवर्धन के दौरान विशिष्ट प्राइमरों, और प्रतिदीप्ति संकेत वृद्धि के प्रत्येक दौर के साथ बढ़ जाती है । जब प्रतिदीप्ति संकेत दहलीज तक पहुँच जाता है, उस दौर/प्रवर्धन का चक्र दहलीज साइकिल (सीटी) के रूप में विख्यात है । संदर्भ फेज डीएनए के ज्ञात सांद्रता उनके सीटी मूल्यों के खिलाफ साजिश के लिए एक मानक वक्र स्थापित कर रहे हैं । डीएनए नमूनों की सीटी मूल्यों के साथ मानक वक्र का उपयोग करना, phages की सांद्रता दुओं जा सकता है ।
जबकि कई रणनीतियों पहले से विकसित किया गया है और बड़े पैमाने पर panning से phages यों तो इस्तेमाल किया, उनमें से प्रत्येक विशिष्ट चुनौतियों है । सबसे लोकप्रिय और पारंपरिक विधि डबल परत पट्टिका परख है । यहां, मेजबान जीवाणु सीरियल कमजोर पड़ने पर तैयार phages से संक्रमित हैं, एक ठोस आगर सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, और आगर के साथ मढ़ा जाता है; phages का गठन सजीले टुकड़े की संख्या के साथ गणना कर रहे हैं (यानी, पट्टिका बनाने इकाइयों या pfu) पर आगर प्लेट. पट्टिका परख संवेदनशील लेकिन थकाऊ, समय लेने वाली और गलत है, विशेष रूप से कई नमूनों के लिए और उच्च सांद्रता5के साथ है । इसके अतिरिक्त, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के लिए M13 और T7 फेज6 कणों,7,8गणना अनुकूलित किया गया है । यहां, विभिंन कमजोर पड़ने पर phages और बंधे है एक ठोस सब्सट्रेट पर कब्जा कर लिया (यानी, एक microplate), फेज के साथ जांच की विशिष्ट एंटीबॉडी, और रिपोर्टर का उपयोग करके पता चला (जैसे, एंजाइम संवेदनशील chromogenic सब्सट्रेट, fluorophores) वर्तमान फेज कणों की संख्या निर्धारित करते हैं । नमूनों की readouts (जैसे, प्रतिदीप्ति, अवशोषण) ज्ञात सांद्रता में फेज मानकों के खिलाफ अज्ञात सांद्रता यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । विभिंन फेज आधारित एलिसा विकसित की गई है लेकिन वे संभावित सीमाएं हैं । एक समूह एक ठहराव रेंज है कि परिमाण के सात आदेश फैले के साथ एक कागज आधारित सैंडविच एलिसा विकसित (102-109 pfu/ हालांकि, इस विधि एंटीबॉडी कोटिंग के कई कदम की आवश्यकता है और8परख के लिए एक पूरे दिन के लिए ले लिया । हमारे समूह ने भी M13 फेज कणों यों तो एक एलिसा विधि विकसित की है लेकिन एक कम संवेदनशील 106 से 1011 pfu/ स्विच lanthanide प्रतिदीप्ति जांच M13 की गणना करने के लिए विकसित किया गया है और ठहराव डेटा 20 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, इस परख 109 से 1012 pfu/एमएल9के एक संकीर्ण गतिशील रेंज है । एक समूह परमाणु बल माइक्रोस्कोपी समाधान में M13 फेज कणों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन इस उन्नत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता है और केवल10सांद्रता की एक संकीर्ण रेंज के भीतर काम किया. एक और अध्ययन फ्लोरोसेंट बूंदों की संख्या से फ्लोरोसेंट M13 और टी-4 रिपोर्टर phages और गिनती phages जाल monodisperse इमल्शन का इस्तेमाल किया; हालांकि, इस दृष्टिकोण भी 102 से 106 pfu/एमएल11से एक संकीर्ण ठहराव रेंज का प्रदर्शन किया । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर M13 phages यों तो इस्तेमाल किया गया है, इस दृष्टिकोण12संक्रामक और गैर संक्रामक फेज कणों की संख्या के बीच अंतर करने में असमर्थ है.
हमारे समूह ने हाल ही में qPCR तरीकों को विकसित किया है T7 और M13 phages एक रक्त मस्तिष्क बाधा सेल मॉडल के खिलाफ panning से पहचाना दो अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर5रंजक का उपयोग कर । aforementioned ठहराव तरीकों की तुलना में, qPCR तरीकों हम विकसित उच्च प्रवाह और समय के लिए कई नमूनों और DNase मैं पूर्व उपचार के साथ संक्रामक और गैर संक्रामक phages के बीच अंतर करने में सक्षम कर रहे थे कुशल फेज नमूने । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण reproducibly और सही ढंग से panning नमूनों से M13 और T7 bacteriophages मात्रा कर सकते हैं । फेज qPCR के क्षेत्र में नौसिखिया शोधकर्ताओं गाइड करने के लिए, यहाँ हम एक विस्तृत qPCR विधि एक फेज-विवश पुस्तकालय से T7 cysteine कणों की गणना करने के लिए का वर्णन (CX7C) एक इन विट्रो सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) बलगम बाधा के खिलाफ panned. इस काम से, qPCR विधि अंय प्रकार की panning और पानी, मिट्टी, और शरीर के तरल पदार्थ सहित अंय स्रोतों से फेज कणों यों तो बढ़ाया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के उपयोग को फेज चयन प्रयोगों (यानी, "" panning ") से T7 phages की गणना करने के लिए वर्णन करता है । qPCR एक प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण डीएनए यों तो है, और यहां, यह फेज कणों के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में फेज जीनोम यों तो है अनुकूलित है । इस प्रोटोकॉल में, एक सतही फेज डीएनए तैयारी विधि अतिरिक्त डीएनए शोधन के बिना उच्च तापमान हीटिंग का उपयोग करते हुए वर्णित है । विधि केवल गर्मी का इलाज phages और qPCR प्रतिक्रिया के छोटे संस्करणों की छोटी मात्रा की जरूरत है । qPCR उच्च प्रवाह और तेजी से, प्रक्रिया और एक ९६ से डेटा प्राप्त करने में सक्षम है-प्रतिक्रियाओं का अच्छी तरह से प्लेट में 2-4 एच अंय फेज गणन दृष्टिकोण की तुलना में, qPCR अधिक समय कुशल है । यहां, qPCR T7 के खिलाफ इन विट्रो सिस्टिक फाइब्रोसिस-बलगम मॉडल की तरह panning से पहचाना phages गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । qPCR विधि अन्य प्रयोगों से T7 phages यों को बढ़ाया जा सकता है, जिसमें अन्य प्रकार की panning (जैसे, मैटीरियल प्रोटीन बाइंडिंग, विवो फेज स्क्रीनिंग में) और अन्य स्रोतों (जैसे, पानी की व्यवस्था या शरीर के तरल पदार्थ) शामिल हैं. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी डीएनए-encapsulated वायरस यों तो संशोधित किया जा सकता है ।

अलग प्राइमर डिजाइन उपकरण qPCR प्राइमरों डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आम तौर पर, प्राइमर डिजाइन कार्यक्रमों की गणना करने और प्राइमरों के प्रमुख मापदंडों को मान्य करने के लिए अ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

T7 भोजी की मात्रात्मक पीसीआर panning से

T7 भोजी की गणना करने के लिए एक reproducible, सटीक और समय कुशल मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) विधि यहां वर्णित है । प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से वर्णन फेज जीनोमिक डीएनए तैयारी, पीसीआर रिएक्शन तैयारी, qPCR सायक्लिंग शर्तों, और qPCR डेटा विश्लेषण ।

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

यह विधि जटिल नमूनों और बैक्टीरियोफेज आधारित निदान और चिकित्सीय से बैक्टीरियोफेज की गणना से संबंधित वायरोलॉजी और माइक्रोबायोलॉजी क्षेत्रों में प्रमुख समस्याओं का जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह पारंपरिक परख के साथ व्यवहार्य नहीं फेज डिस्प्ले बायोपैनिंग प्रयोगों से बड़ी संख्या में नमूनों के कुशल और सटीक मात्राकरण को सक्षम बनाता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन रश्मि मोहंती और जैमिम लील, मेरी प्रयोगशाला से स्नातक छात्र होंगे ।प्राइमर डिजाइन करने और स्टॉक एकाग्रता बनाने के बाद, 0.1 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एकाग्रता पर संदर्भ T7 फाज डीएनए प्राप्त करें। अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके, इस डीएनए को दस गुना पतला करें, ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों में प्रति माइक्रोलीटर एक फीमेलर प्रति फीमेलर प्रति फीमेलर से दस गुना । प्रत्येक एकाग्रता के 20 माइक्रोलीटर तैयार करें, जिससे कमजोर पड़ने के प्रत्येक चरण के बीच ट्यूबों को पिपेट टिप्स और भंवर बदलना सुनिश्चित हो।फिर T7 फाज संदर्भ डीएनए एकाग्रता को फीस्टोग्राम प्रति माइक्रोलीटर से जीनोम प्रतियों प्रतियों में परिवर्तित करें। सबसे पहले, 10 वांछित नमूनों में से प्रत्येक के लिए 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में नमूना T7 फाज क्लोन के पिपेट 200 माइक्रोलीटर। प्रत्येक ट्यूब में DNase एक के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।ट्यूबों को कैप करें और गर्म सूखे स्नान में 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर एक गर्म शुष्क स्नान में 15 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 10 सेकंड के लिए 18, 534 बार जी पर गर्मी का इलाज फैज युक्त ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें।फेंस को मिलाने के लिए 10 सेकंड के लिए टच एक्टिवेशन मोड पर सेट भंवर मिक्सर पर सेंट्रलाइज्ड ट्यूब्स रखें। 10 सेकंड के लिए 18, 534 बार जी पर फिर से स्पिन करें। इसके बाद, नमूनों को प्रयोगशाला बेंच पर लगभग एक घंटे के लिए उन्हें कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए छोड़ दें।अज्ञात एकाग्रता के 10 बायोपैन्ड फैज नमूनों और ट्रिपलीकेट में मानक सांद्रता के सात नमूनों के लिए क्यूपीसीआर प्रीमिक्स तैयार करें। जिसके परिणामस्वरूप क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के 255 माइक्रोलीटर, प्राइमर के 51 माइक्रोलीटर और 102 माइक्रोलीटर पानी वाले 51 नमूनों के लिए प्रीमिक्स का परिणाम है। अलीकोट तैयार पीसीआर के आठ माइक्रोलीटर एक ९६-अच्छी तरह से qPCR प्लेट के ५१ कुओं में मिश्रण ।इसके बाद इन कुओं में से प्रत्येक के लिए गर्मी का इलाज T7 phage नमूनों के दो माइक्रोलीटर जोड़ें, यह qPCR प्रीमिक्स की सतह के नीचे वितरण । चिपकने वाली फिल्म का उपयोग करना, थाली सील। फ्लोरेसेंस फोटो ब्लीचिंग को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेट लपेटें और फिर क्यूपीसीआर उपकरण पर प्लेट चलाने के लिए आगे बढ़ें।पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित साइकिलिंग की स्थिति और पिघल वक्र सेटिंग्स की स्थापना करें। क्यूपीसीआर चलने के बाद, कच्चे डेटा से प्रवर्धन प्लॉट, पिघल वक्र प्लॉट और मल्टीकंपोनेंट प्लॉट का विश्लेषण किया जाता है। प्रवर्धन भूखंड इंगित करता है कि प्रत्येक नमूने की पीसीआर प्रवर्धन सफल है या नहीं।बहुसंकल्पीय भूखंड पूरे प्रवर्धन चक्रों में फ्लोरोसेंट सिग्नल के प्रवर्धन और क्षय का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि पिघल वक्र भूखंड का उपयोग प्राइमर की विशिष्टता को मान्य करने के लिए किया जाता है, क्योंकि प्रत्येक पीसीआर उत्पाद में एक अद्वितीय पिघलने का तापमान होता है। मानक वक्र तो संदर्भ डीएनए से उत्पन्न होता है।यहां प्रवर्धन दक्षता की गणना क्यूपीसीआर अध्ययन से 92.4% प्रतिनिधि डेटा के रूप में की जाती है, तब उसी फैज की तुलना की जाती है जिसे माइक्रोलीटर प्रति 10 से 10 मिलियन जीनोम प्रतियों की परीक्षण की गई सीमा पर डबल लेयर पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया था। जैसा कि यहां देखा गया है, क्यूपीसीआर क्वांटिटेशन में फेज की संख्या पट्टिका परख की तुलना में अधिक है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय क्यूपीसीआर विधि की पुनरावृत्ति में 2.85 से 27.2% तक मूल्य होते हैं, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि क्यूपीसीआर के विकास और उपयोग में कई विचार हैं, जिसमें सावधानीपूर्वक उपचार और नमूनों की तैयारी और प्रासंगिक उपकरणों के अंशांकन शामिल हैं।इस विधि के बाद, अन्य तकनीकों को विभिन्न अनुप्रयोगों में फेज कणों की गणना करने के लिए किया जा सकता है जिसमें वीवो बायोपैनिंग, फाज लाइब्रेरी डीएनए तैयारी और जटिल पर्यावरणीय नमूनों में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और फाज डिटेक्शन शामिल हैं। यह न भूलें कि प्रयोगशाला में फैज को जैविक खतरे माना जाता है और प्रक्रिया को निष्पादित करते समय दस्ताने और प्रयोगशाला कोट सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण जैसी सावधानियां हमेशा पहनी जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

उच्च throughput मात्रात्मक वास्तविक समय आरटी पीसीआर परख प्रकार मैं और तृतीय इंटरफेरॉन उपप्रकार की अभिव्यक्ति प्रोफाइल निर्धारण के लिए

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

विकास और श्वसन तरल पदार्थ में Equid herpesvirus -2 निदान के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के मान्यकरण

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

की जीनोटाइपिंग<em&gt; स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em&gt; द्वारा Ribosomal स्पेसर पीसीआर (RS-पीसीआर)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

नेनो पीसीआर द्वारा पशु नमूनों में श्वसन रोगज़नक़ों के उच्च throughput जांच

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

एक मात्रात्मक माइक्रो निराकरण परख के अनुकूलन

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

अलगाव और माउस Tracheas से ब्रश कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

रेबीज निदान के लिए पैन-लिसवायरस रियल टाइम आरटी-पीसीआर

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

एपिजेनेटिक-आधारित मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके प्रतिरक्षा सेल पहचान और शुद्धता का निर्धारण

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

प्रतिरक्षण और मात्रात्मक पीसीआर द्वारा व्हाइटफ्लाई ऊतकों में बेगोमोवायरस का स्थानीयकरण और परिमाणीकरण

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...