Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
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この作品は、PhRMA 財団研究スタート助成金によって支えられたし、国立心臓、肺、血液研究所健康のある国民の協会の受賞番号 R01HL138251 の下で付与します。

1. プライマー設計や T7 バクテリオファージのゲノム DNA の解析
<ol><li>T7 ファージのゲノム DNA の増幅用プライマーを設計します。 注: F (フォワード) と R (リバース) プライマー (材料の表を参照してください) は、T7 DNA シーケンスを増幅ライブラリ変数領域 (図 1) の上流に位置します。</li>
	<li>融解温度 (Tm)、パーセントの GC 含量 (GC %)、プライマー二量体...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

QPCR ファージ ゲノム DNA の5を定量化する方法を開発したし、ここで述べると CF のような粘液のバリアに対して選択された T7 ファージを列挙する qPCR 法を適応。出版物の量的なリアルタイム PCR 実験 (MIQE) のガイドラインについては最低限の情報は、開発し、qPCR T7 ファージ15の列挙法を検証する合わせられました。我々 はバイオパニング実験からファージ?...

1985 年にジョージ ・ スミスによって開発されたバクテリオファージ (ファージ) ディスプレイ技術は、ターゲットまたは細胞膜、病抗原、細胞細胞器官または特定の受容体に対するペプチドやタンパク質のリガンドを識別するために強力な高スループット方法臓器や組織で過去二十年1,2。ここでは、(通常 M13 または T7) に感染するバクテリオファージのコート蛋白質のポリペプチドや一本鎖抗体のランダムなライブラリが表示され、体外固定された蛋白質またはin vivoに対してパンから特異的なリガンドを識別できます。反復的な選択プロセスを生物学的システムは。次に、イメージングや治療エージェント疾患3,4の診断と治療をリガンドに結合できます。バイオパニングの複数のステップ中にファージを正確に列挙することが重要: 基質に結合するファージを定量化するには (1) と (2) 選択の各ラウンドでの濃縮があるかを決定するファージを定量化する (バクテリオファージ濃縮 biopanned を示しています。ターゲットのバクテリオファージが関係したため)。定量化、二重層プラクの試金のための現在のゴールド スタンダード複数課題;それは退屈な面倒なサンプル数が多いため不正確な可能性があります。したがって、当社グループは、バイオパニング5から M13 と T7 バクテリオファージの粒子を列挙する機密性の高い、再現可能な正確な時間効率的な量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) メソッドを開発しました。
qPCR、T7 と M13 ファージを正確に定量化する魅力的な実行可能な方法です。それぞれ個々 のバクテリオファージの粒子のみ (dsDNA または ssDNA) ゲノムの DNA の 1 つのコピーを含めることができます、ので 1 ファージのゲノムは 1 つのバクテリオファージの粒子; に相当バクテリオファージのゲノムの数を定量化することでファージの数を定量化することは不可能です。QPCR、蛍光レポーターの中に染料が非具体的バクテリオファージのゲノム DNA をバインドまたは具体的に配列特異プライマー PCR 増幅中と蛍光は、信号増幅の各ラウンドで増加します。蛍光信号を増幅のラウンド/サイクルしきい値に達したときは、しきい値サイクル (Ct) として示されています。標準曲線を確立する Ct 値に対する参照バクテリオファージ DNA 既知濃度のプロットします。DNA サンプルの Ct 値を持つ標準的なカーブを使用して、ファージの濃度を補間することができます。
多くの戦略を以前に開発し、広範囲バイオパニング ファージを定量化するために使用、それぞれの特定の課題があります。最も人気があり従来の方法は二重層プラクの試金です。ここでは、ホスト細菌シリアル希薄で作製したファージに感染している、固体寒天基板上メッキ、かぶせている寒天。ファージは、プラック数 (すなわち、プラーク形成単位または pfu) 寒天プレート上で列挙されます。プラクの試金は敏感が、退屈な時間のかかる、不正確で、特に多数のサンプルと高濃度5 です。また、酵素抗体法 (ELISA) は M13 と T7 ファージ粒子6,7、8を列挙に適応されています。異なる希釈率でファージがここでは、バインドされていると (すなわち、マイクロ プレート) 固体基板上捕獲、バクテリオファージ特異抗体を検出し、(例えば、酵素敏感 chromogenic 基板、フルオロ) の記者を使用して検出現在のバクテリオファージの粒子の数を決定します。サンプルの読み出し (例えば蛍光、吸光度) は、既知濃度のバクテリオファージの標準に対して未知濃度を定量化する使用できます。異なるファージを用いた Elisa が開発されているが、彼らは潜在的な制限があります。1 つのグループ 7 桁 (102-109 pfu/mL); スパン定量化の範囲で紙ベースのサンドイッチ elisa 法の開発ただし、このメソッドは、抗体コーティングの複数の手順が必要、試金8の全体の日取った。当社グループはまた M13 バクテリオファージの粒子を定量化する ELISA 法を開発したが、10 のより少なく敏感な検出範囲を持っていた6  1011 pfu/mL5。M13 を列挙する切替ランタニド蛍光プローブが開発され、定量データを取得; 20 分以内でした。ただし、この試金はダイナミック レンジの狭い 109 1012 pfu/mL9。1 つのグループは、ソリューションでは、M13 バクテリオファージの粒子を列挙する原子間力顕微鏡を使用が、これは高度な電子顕微鏡が必要ですのみ濃度10の狭い範囲の内で働いた。別の調査は、蛍光の M13 と T4 記者ファージをトラップし、蛍光の液滴の数によってファージをカウントする単分散エマルジョンを使用ただし、このアプローチはまた 10 から狭い定量化の範囲を展示2 106 pfu/mL11。液滴デジタル PCR は M13 ファージを定量化に使用されています中、は、このアプローチは伝染性および非伝染性のバクテリオファージの粒子の12の数の間で区別することができます。
当社グループは、qPCR T7 と M13 ファージに対して細胞の血液脳関門モデル 2 つの異なる蛍光レポーター色素5を使用してバイオパニングから特定の列挙方法を最近開発しました。前述の定量化方法と比較して、我々 が開発した qPCR 方法だった高スループットかつ多数サンプルを定量化する時間効率的であり DNase で伝染性および非伝染性のバクテリオファージの前処置を区別することが、バクテリオファージのサンプル。重要なは、このアプローチ再現性をもって、正確に定量化できます M13 と T7 バクテリオファージ バイオパニング サンプルから。バクテリオファージ qPCR 地区初心者研究者を導くためここで我々 は嚢胞性線維症 (CF)の in vitro粘液障壁に対してパン システインに制約があるライブラリ (CX7C) から T7 バクテリオファージの粒子を列挙する詳細な qPCR 法をについて説明します。この作品からは、バイオパニングの他の種類から、水、土壌、体液などの他のソースからのバクテリオファージの粒子を定量化する qPCR 法を拡張できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

このプロトコルでは、ファージの選択実験を (すなわち、 「バイオパニング」) から T7 ファージを列挙する定量的 PCR (qPCR) の使用について説明します。qPCR DNA を定量化する蛍光ベースのアプローチは、ここで、それはバクテリオファージの粒子のためのプロキシとしてバクテリオファージのゲノムを定量化する適応。このプロトコルでは追加の DNA 精製することがなく高温加熱による安易なファージ DNA の調製法を説明します。メソッドには、熱処理したファージの量が少ないと qPCR 反応の量が少ないだけ必要があります。qPCR、高スループット、高速で処理し、列挙体の他のバクテリオファージのアプローチに 2-4 との比較における反応の 96 ウェル プレートからデータを取得することができる、qPCR は時間効率的です。ここでは、qPCR を使用して嚢胞性線維症のような粘液の in vitroモデルに対してバイオパニングから識別 T7 ファージを列挙します。バイオパニングの他のタイプを含む、他の実験から T7 ファージを定量化する qPCR 法を拡張できます (e.g。、バクテリオファージ スクリーニングの蛋白結合、体内を固定化) およびその他のソース (例えば、水システムまたは体液)。要約すると、このプロトコルは DNA でカプセル化されたウイルスを定量化する変更できます。

異なるプライマー デザイン ・ ツールは、qPCR プライマーを設計する使用ことができます。通常、プライマー設計プログラムがある計算し、一般的にプライマー、GC %などTm、プライマー二量体またはヘアピン形成などの主要なパラメーターを検証する組み込みアルゴリズム、キー条件が異なるのと同様プライマー デザイン ・ ツール、およびプライマー?...

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Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

バイオパニングから T7 バクテリオファージの量的な PCR

再現性の高い、正確で、時間効率的な定量的 PCR (qPCR) を列挙するメソッド T7 バクテリオファージを次に紹介します。プロトコルはバクテリオファージ DNA 調製法、PCR 反応の準備、qPCR サイクリング条件、qPCR データ分析明確にについて説明します。

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

この方法は、複雑なサンプルおよびバクテリオファージベースの診断および治療からバクテリオファージの列挙に関連するウイルス学および微生物学分野の主要な問題に答えるのに役立つ可能性がある。この技術の主な利点は、従来のアッセイでは実現不可能なファージディスプレイバイオパンニング実験から多数のサンプルを時間効率よく正確に定量化できる点にあります。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるラシュミ・モハンティとジャスミン・リールです。プライマーを設計し、ストック濃度を作成した後、マイクロリットル当たり0.1マイクログラムの濃度でT7ファージDNAを参照してください。超純水を使用して、このDNAをマイクロリットル当たり100万フェムトグラムから0.2ミリリットルPCRチューブでマイクロリットル当たり1個のフェムトグラムまで10倍に連続して希釈します。各濃度の20マイクロリットルを調製し、希釈の各段階の間にピペットチップと渦管を変更することを確認します。次に、T7ファージ参照DNA濃度をマイクロリットル当たりのフェムトグラムからマイクロリットル当たりのゲノムコピーに変換します。まず、サンプルT7ファージクローンのピペット200マイクロリットルを、10個の所望のサンプルのそれぞれについて1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れます。各チューブに2マイクロリットルのDNaseを1つずつ加えます。チューブをキャップし、加熱された乾燥した浴で10分間摂氏37度でインキュベートします。その後、加熱された乾燥した浴で15分間摂氏100度でインキュベートします。熱処理ファージを含むチューブを18、534回gで10秒間遠心分離する。遠心チューブをタッチアクティベーションモードで10秒間設定した渦ミキサーに置き、ファージを混合します。18、534回gで10秒間再びスピンします。この後、試料を室温まで冷却するために、約1時間実験室ベンチに置いておきます。未知の濃度の10のバイオパンニングファージサンプルと三重濃度の標準濃度の7つのサンプルのためのqPCRプレミックスを準備しなさい。255マイクロリットルのqPCRマスターミックス、プライマー51マイクロリットル、水102マイクロリットルを含む51サンプルのプレミックスを得た。調製したPCRのアリコート8マイクロリットルは、96ウェルqPCRプレートの51ウェルに混合します。次に、これらのウェルのそれぞれに熱処理T7ファージサンプルの2マイクロリットルを追加し、qPCRプレミックスの表面の下に分配します。粘着フィルムを使用して、プレートを密封します。蛍光光の漂白を最小限に抑えるために、アルミニウム箔でプレートを包み、次にqPCR装置上でプレートを実行するに進みます。テキストプロトコルで説明されているように、サイクリング条件とメルトカーブの設定を設定します。qPCR を実行すると、増幅プロット、メルトカーブプロット、およびマルチコンポーネントプロットが生データから分析されます。増幅プロットは、各サンプルのPCR増幅が成功したかどうかを示します。多成分プロットは、増幅サイクル全体にわたって蛍光シグナルの増幅と減衰を表します。メルトカーブプロットはプライマーの特異性を検証するために使用されますが、各PCR製品には1つのユニークな溶融温度があるためです。標準曲線は、次いで参照DNAから生成されます。ここで、増幅効率は、qPCR研究から92.4%代表データと計算され、その後、1マイクロリットル当たり1000万~1000万ゲノムコピーの試験範囲で二重層プラークアッセイによって定量されたのと同じファージと比較される。ここで見られるように、qPCR定量中のファージの数は、プラークアッセイよりも高い。分散係数で表されるqPCR法の再現性は、この手順を試みる間、2.85~27.2%の範囲の値を有すると見られるが、試料の慎重な処理や調製、関連機器の較正など、qPCRの開発と使用に多くの考慮事項があることを覚えておくことが重要である。この方法に従って、生体内バイオパニング、ファージライブラリーDNA調製および次世代シーケンシングおよびファージ検出に含まれる様々な用途においてファージ粒子を複雑な環境試料に列挙するために他の技術を行うことができる。ファージは実験室で生物学的危険と見なされ、手袋やラボコートを含む個人的な保護具などの予防措置は、手順を実行しながら常に着用する必要があることを忘れないでください。

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ヒト血液の小さなサンプルから単球および樹状細胞のlineage特異的Toll様受容体を介するシグナル伝達の定量的イメージング

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

呼吸器流体におけるウマヘルペスウイルス-2の診断のための定量的PCR法の開発と検証

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

定量的マイクロ中和アッセイの最適化

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

エピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...