Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av PhRMA Foundation Starter forskningsstipend og nasjonale hjerte, lunge og blod Institutt for National Institutes of Health gi prisen nummer R01HL138251.

1. primer Design og analyse for T7 Phage genomisk DNA
<ol><li>Utforme primere for forsterkning av T7 phage genomisk DNA. Merk: F (fremover) og R (bakover) primer (se Tabell for materiale) forsterke T7 DNA sekvensen ligger oppstrøms av biblioteket variable regionen (figur 1).</li>
	<li>Velg en passende primer analyserer evaluere parametere primerne, inkludert Smeltetemperaturen (Tm), prosent GC innhold (GC %), primer dimers, hårnål formasjon og PCR egnethet (<strong c...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Vi utviklet qPCR metoder for å kvantifisere phage genomisk DNA5, og her vi beskrev og tilpasset en qPCR metode for å liste opp T7 phages valgt mot en CF-lignende Slim barriere. Minimum informasjon om retningslinjer for publisering av kvantitative Real-Time PCR eksperimenter (MIQE) ble tilpasset for å utvikle og validere metoden qPCR for opplisting T7 phages15. Protokollen vi utviklet for å kvantifisere phages fra biopanning eksperimenter er en tidkrevende, pålitelig og...

Bacteriophage (phage) teknologien, utviklet av George Smith i 1985, er en kraftig, høy gjennomstrømming tilnærming til å identifisere peptid eller protein ligander mot mål eller reseptorer cellemembranen, sykdom antigener, mobilnettet organeller eller spesifikke organer og vev i de siste to tiår1,2. Her, tilfeldig biblioteker av polypeptides eller enkelt kjede antistoffer vises på frakken proteiner av phages (vanligvis M13 eller T7), og bestemte ligander kan identifiseres fra panorering mot immobilisert proteiner i vitro eller i vivo biologiske systemer gjennom en iterativ utvelgelsesprosessen. Deretter kan ligander kombineres med bildebehandling eller terapeutiske agenter for diagnostisering og behandling av sykdommer3,4. Det er viktig å nøyaktig liste phages i flere trinnene i biopanning: (1) å kvantifisere phages som binder til underlaget og (2) å kvantifisere phages om det er berikelse med hver runde utvalg (phage berikelse angir biopanned phage affinitet for målet). Gjeldende gullstandarden for kvantifisering, tolags plakk analysen, presenterer flere utfordringer; Det er kjedelig, tungvint og potensielt unøyaktige for mange eksempler. Derfor har vår gruppe utviklet en følsom, reproduserbare, nøyaktig og tidseffektive kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR) metode for å nummerere M13 og T7 phage partikler fra biopanning5.
qPCR er en attraktive og gjennomførbare metoden å tallfeste nøyaktig T7 og M13 phages. Siden hver individuelle phage partikkel kan bare inneholde én kopi av genomisk DNA (dsDNA eller ssDNA), tilsvarer en phage genomet en phage partikkel; kvantifisere antall phage genomer, er det mulig å kvantifisere antall phages. Under qPCR, fluorescerende reporter fargestoffer binde phage genomisk DNA nonspecifically eller spesielt gjennom sekvens-spesifikke primere under PCR forsterkning og fluorescensen signal øker med hver runde forsterkning. Når fluorescens signalet når grenseverdien, som runde/syklus av forsterkning er kjent som den terskel syklusen (Ct). Kjente konsentrasjonen av referanse phage DNA plottes mot Ct verdiene for å etablere en standard kurve. Bruk av standardkurve med Ct verdiene av DNA-prøver, kan konsentrasjonen av phages være interpolert.
Mens mange strategier har vært utviklet og mye brukt om å kvantifisere phages fra biopanning, har hver av dem spesifikke utfordringer. Den mest populære og konvensjonelle metoden er tolags plakk analysen. Her, vert bakterier er infisert med phages forberedt på seriell fortynninger, er belagt på et solid agar substrat og er kledde med agar; phages er nummerert med antall plaketter dannet (dvs. plakk danner enheter eller pfu) på agar tallerkenen. Plakk analysen er følsom men kjedelig, tidkrevende og unøyaktig, spesielt for mange eksempler og med høye konsentrasjoner5. I tillegg er enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA) tilpasset nummerere M13 og T7 phage partikler6,7,8. Her phages på ulike fortynninger er bundet og tatt på et solid substrat (dvs. en microplate), analysert med phage-spesifikke antistoffer og oppdaget med journalister (f.eks enzym følsom kromogent underlag, fluorophores) å bestemme antall phage partikler tilstede. Readouts (f.eks fluorescens, absorbans) av prøver kan brukes å kvantifisere ukjent konsentrasjoner mot phage standarder i kjente konsentrasjoner. Forskjellige phage-baserte ELISAs har blitt utviklet, men de har potensielle begrensninger. En gruppe utviklet en papirbasert sandwich ELISA med et kvantifisering område som spredte syv størrelsesordener (102-109 pfu/mL); men denne metoden krevde flere trinn av antistoff belegg og tok opp til en hel dag for analysen8. Vår gruppe også utviklet en ELISA metode for å kvantifisere M13 phage partikler, men hadde en mindre sensitive rekkevidde på 106  1011 pfu/mL5. Valgbar transisjonsmetall fluorescens sonder er utviklet for å nummerere M13 og kvantifisering data kan hentes innen 20 min; Denne analysen har imidlertid et lite dynamisk område med 109 til 1012 pfu/mL9. En gruppe brukt atomic force mikroskopi nummerere M13 phage partikler i løsningen, men dette krever avansert elektronmikroskop og bare jobbet innenfor et lite område med konsentrasjoner10. En annen studie brukes monodisperse emulsjoner å felle fluorescerende M13 og T4 reporter phages og telle phages på antall fluorescerende dråper; men denne tilnærmingen også utstilt en smal kvantifisering varierer fra 102 til 106 pfu/mL11. Mens slippverktøy digital PCR har blitt brukt om å kvantifisere M13 phages, er denne tilnærmingen stand til å skille mellom den smittsomme og ikke-smittsomme phage partikler12.
Vår gruppe har nylig utviklet qPCR metoder for å liste opp T7 og M13 phages identifisert fra biopanning mot en blod - hjerne barrieren celle modell bruker to ulike fluorescerende reporter fargestoffer5. Sammenlignet med nevnte kvantifisering metoder, qPCR metodene vi utviklet var høy gjennomstrømming og tidkrevende å kvantifisere mange eksempler og kunne skille mellom infeksjonssykdommer og ikke-smittsomme phages med DNase jeg pre-behandling av den phage prøver. Viktigere, kan denne tilnærmingen reproduserbar og nøyaktig kvantifisere M13 og T7 bacteriophages fra biopanning prøver. For å veilede nybegynnere forskere innen phage qPCR, beskriver her vi en detaljert qPCR metode for å liste opp T7 phage partikler fra et cystein begrenset bibliotek (CX7C) panorert mot en i vitro cystisk fibrose (CF) slim-barriere. Fra dette arbeidet, kan qPCR metoden utvides for å kvantifisere phage partikler fra andre typer biopanning og fra andre kilder, inkludert vann, jord og kroppsvæsker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Denne protokollen beskriver bruken av kvantitative PCR (qPCR) til å nummerere T7 phages fra phage utvalg eksperimenter (dvs. "biopanning"). qPCR er en fluorescens tilnærming å kvantifisere DNA, og her er det tilpasset å kvantifisere phage genomer som en proxy for phage partikler. I denne protokollen beskrives lettvinte phage DNA forberedelse metode med høy temperatur varme uten ekstra DNA rensing. Metoden må bare små mengder varmebehandlet phages og små mengder qPCR reaksjonen. qPCR er høy gjennomstrømming og rask, behandle og hente data fra en 96-brønns plate reaksjoner i 2-4 h. forhold til andre phage opplisting tilnærminger, qPCR er mindre tidkrevende. Her qPCR til å Nummerer T7 phages identifisert fra biopanning mot i vitro cystisk fibrose-lignende Slim modell. Metoden qPCR kan utvides for å kvantifisere T7 phages fra andre eksperimenter, inkludert andre typer biopanning (f.eks., immobilisert protein bindende, i vivo phage screening) og andre kilder (f.eks vannsystemer eller kroppsvæsker). I sammendraget, kan denne protokollen endres for å kvantifisere DNA-innkapslet virus.

Forskjellige primer verktøy kan brukes til å utforme qPCR primere. Vanligvis primer design programmer har sin egen innebygde algoritmer for å Beregn og Valider nøkkelparameterne grunning, f.eks GC %, Tm, primer dimer eller hårnål formasjon, etc. generelt, de viktigste kriteriene er lignende i ulike primer verktøy og primere kan utformes fulgt sine instruksjoner. Primer BLAST kan brukes til å bekrefte spesifisitet primerne. En primer par mot oppstrøms av variable...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage fra Biopanning

En reproduserbare, nøyaktig og tid effektiv kvantitative PCR (qPCR) metode for å liste opp T7 bacteriophage er beskrevet her. Protokollen tydelig beskriver phage genomisk DNA forberedelse, PCR reaksjon forberedelse, qPCR sykling forhold og qPCR dataanalyse.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige problemer innen virologi og mikrobiologi felt knyttet til opplisting av bakteriofages fra komplekse prøver og bakteriofag basert diagnostikk og terapeutiske midler. Den største fordelen med denne teknikken er at det muliggjør tidseffektiv og nøyaktig kvantifisering av et stort antall prøver fra phage display biopanning eksperimenter som ikke er mulig med tradisjonelle analyser. Demonstrere prosedyren vil være Rashmi Mohanty og Jasmim Leal, graduate studenter fra laboratoriet mitt.Etter å ha designet primers og skape en lagerkonsentrasjon, få referanse T7 phage DNA i en konsentrasjon på 0,1 mikrogram per mikroliter. Ved hjelp av ultrarent vann, fortynne dette DNA tidoblet, fra en million femtogrammer per mikroliter til en femtogrammer per mikroliter i 0,2 milliliter PCR rør. Forbered 20 mikroliter av hver konsentrasjon, og sørg for å bytte pipettespisser og virvle rørene mellom hvert trinn av fortynningen.Deretter konverterer T7 phage referanse DNA konsentrasjon fra femtogrammer per mikroliter til genom kopier per mikroliter. Først pipette 200 mikroliter av prøven T7 phage klone i en 1,5 milliliter mikro sentrifuge rør for hver av de 10 ønskede prøvene. Legg til to mikroliter dnase en til hvert rør.Cap rørene og inkubere på 37 grader Celsius i 10 minutter i et oppvarmet tørt bad. Deretter inkubere ved 100 grader celsius i 15 minutter i et oppvarmet tørt bad. Sentrifuger rørene som inneholder de varmebehandlede phages ved 18, 534 ganger g i 10 sekunder.Plasser sentrifugerte rør på en vortex mikser satt ved berøring aktiveringsmodus i 10 sekunder for å blande phages. Spinn igjen ved 18, 534 ganger g i 10 sekunder. Etter dette, la prøvene på laboratoriebenken omtrent en time for å kjøle dem til romtemperatur.Forbered qPCR premix for 10 biopanned phage prøver av ukjent konsentrasjon og syv prøver av standard konsentrasjoner i triplikate. Resulterer i en premix for 51 prøver som inneholder 255 mikroliter qPCR master mix, 51 mikroliter av primere og 102 mikroliter vann. Aliquot åtte mikroliter av den tilberedte PCR-blandingen i 51 brønner av en 96-brønns qPCR-plate.Deretter legger du til to mikroliter varmebehandlede T7-phage-prøver til hver av disse brønnene, og dispenserer den under overflaten av qPCR-premixen. Bruk klebende film, forsegle platen. Pakk platen i aluminiumsfolie for å minimere fluorescens fotobleking og deretter fortsette å kjøre platen på qPCR utstyr.Konfigurer sykkelforholdene og innstillingene for smeltekurve som beskrevet i tekstprotokollen. Når qPCR er kjørt, analyseres forsterkningsplottet, smeltekurveplottet og multikomponentplottet fra rådataene. Forsterkningsplottet angir om PCR-forsterkningen av hvert utvalg er vellykket eller ikke.Multikomponentplottet representerer forsterkning og forfall av fluorescerende signal gjennom forsterkningssyklusene. Mens smeltekurveplottet brukes til å validere spesifisiteten til primerne, siden hvert PCR-produkt har en unik smeltetemperatur. Standardkurven genereres deretter fra referanse-DNA.Her beregnes forsterkningseffektiviteten til å være 92,4 % Representative data fra en qPCR-studie blir deretter sammenlignet med samme phage som ble kvantifisert av en dobbeltlags plakkanalyse ved det testede området på 10 til 10 millioner genomkopier per mikroliter. Som sett her er antall phages i qPCR-kvantiteten høyere enn i plakkanalysen. Repeterbarheten av qPCR-metoden som representert ved variansens koeffisient anses å ha verdier fra 2,85 til 27,2%Mens du forsøker denne prosedyren, er det viktig å huske at det er mange hensyn i utvikling og bruk av qPCR for å nøyaktig kvantifisere phages, inkludert forsiktig behandling og fremstilling av prøver og kalibrering av relevant utstyr.Etter denne metoden kan andre teknikker utføres for å liste opp phage partikler i en rekke applikasjoner inkludert i vivo biopanning, phage bibliotek DNA forberedelse og neste generasjons sekvensering og phage deteksjon i komplekse miljøprøver. Ikke glem at phages anses biologiske farer i laboratoriet og forholdsregler som personlig verneutstyr, inkludert hansker og laboratoriefrakker, bør alltid brukes mens du utfører prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ Imaging av Lineage-spesifikke Toll-like receptor-mediert signalering i monocytter og dendrittiske celler fra små prøver av Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Utvikling og validering av en kvantitativ PCR metode for Equid herpesvirus-2 Diagnostics i respirasjonsorganer Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotyping av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; av Ribosomalt Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimalisering av en kvantitativ Micro-nøytralisering analyse

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolasjon og kvantitativ evaluering av Brush celler fra mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for rabies diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Bestemmelse av immuncelleidentitet og renhet ved hjelp av epigenetisk basert kvantitativ PCR

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Lokalisering og kvantifisering av begomovirus i whitefly vev av immunofluorescens og kvantitativ pcr

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...