Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por PhRMA Foundation Research Grant Starter e nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue do institutos nacionais da saúde concedem sob número prêmio R01HL138251.

1. primer Design e análise de DNA genômico do fago T7
<ol><li>Desenho de primers para amplificação de DNA genômico do fago T7. Nota: F (frente) e as primeiras demão R (reverso) (ver Tabela de materiais) amplificam a sequência de DNA T7 localizado a montante da região variável da biblioteca (Figura 1).</li>
	<li>Escolha um analisador primário adequado para avaliar parâmetros dos primers, incluindo a temperatura de fusão (Tm), porcentagem conteúdo GC (GC %), ...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Desenvolvemos métodos de qPCR para quantificação de DNA genômico do fago5, e aqui descrevemos e adaptou um método de qPCR para enumerar fago T7 selecionado contra uma barreira de muco tipo CF. Informações mínimas para diretrizes de publicação do quantitativo real-time PCR experimentos (MIQE) foram adaptados para desenvolver e validar o método de qPCR para enumeração de T7 fago15. O protocolo que desenvolvemos para quantificar o fago de experimentos biopanning ?...

Tecnologia de exibição do bacteriófago (fago), desenvolvida por George Smith em 1985, é uma abordagem poderosa, elevado-throughput para identificar peptídeos ou proteínas ligantes contra alvos ou receptores da membrana celular, organelas celulares, antígenos da doença ou específicos órgãos e tecidos nas últimas duas décadas1,2. Aqui, bibliotecas aleatórias de polipeptídeos ou anticorpos de cadeia única são exibidas sobre as proteínas do casaco do fago (tipicamente M13 ou T7) e ligantes específicos podem ser identificados de garimpar contra proteínas imobilizadas em vitro ou in vivo sistemas biológicos, através de um processo de seleção iterativa. Então, ligantes podem ser acoplados com agentes terapêuticos ou de imagem para diagnóstico e tratamento de doenças3,4. É fundamental para enumerar com precisão o fago durante várias etapas de biopanning: (1) para quantificar o fago que ligam-se ao substrato e (2) para quantificar o fago para determinar se há enriquecimento com cada rodada de seleção (enriquecimento do fago indica biopanned afinidade do fago para o destino). O atual padrão de ouro para quantificação, ensaio de chapa de dupla camada, apresenta vários desafios; é tedioso, complexos e potencialmente impreciso para um grande número de amostras. Portanto, nosso grupo desenvolveu um método de (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativo sensível, reprodutível, precisos e tempo-eficiente para enumerar as partículas do fago M13 e T7 de biopanning5.
qPCR é um método atraente e viável quantificar com precisão o fago T7 e M13. Desde que cada partícula individual do fago pode conter apenas uma cópia do DNA genômico (dsDNA ou ssDNA), um genoma do fago é equivalente a uma partícula fago; quantificando o número de genomas do fago, é possível quantificar o número de fago. Durante qPCR, repórter fluorescente corantes ligam o DNA genômico do fago não especìfica ou especificamente por meio de cartilhas específicas durante a amplificação por PCR e a fluorescência sinal aumenta com cada rodada de amplificação. Quando o sinal de fluorescência atinge o limite, que rodada/ciclo da amplificação é conhecido como o ciclo de limiar (Ct). As concentrações conhecidas de referência do fago DNA são plotadas contra seus valores de Ct para estabelecer uma curva padrão. Usando a curva padrão com os valores de Ct de amostras de DNA, as concentrações do fago podem ser interpoladas.
Enquanto inúmeras estratégias foram anteriormente desenvolvidas e usadas extensivamente para quantificar o fago de biopanning, cada um deles tem desafios específicos. O método mais popular e convencional é o ensaio da chapa de dupla camada. Aqui, o anfitrião bactérias estão infectadas com fago preparado em diluições em série, são banhadas em um substrato sólido ágar e são revestidas com ágar; fagos são enumerados com o número de placas formado (ou seja, placa formando unidades ou pfu) na placa de ágar. Ensaio de placa é sensível mas tedioso, demorado e impreciso, especialmente para numerosas amostras e com altas concentrações de5. Além disso, ensaios imunoenzimático (ELISA) foram adaptados para enumerar M13 e T7 fago partículas6,7,8. Aqui, o fago em diferentes diluições é vinculado e capturado em um substrato sólido (ou seja, uma microplaca), sondado com anticorpos específicos do fago e detectados por meio de repórteres (por exemplo, enzima sensível cromogênico substratos, fluorophores) para Determine o número de partículas do fago presentes. As leituras (por exemplo, fluorescência, absorbância) das amostras podem ser usadas para quantificar as concentrações desconhecidas contra normas do fago em concentrações conhecidas. Diferentes baseados no fago ELISAs têm sido desenvolvidas, mas têm limitações potenciais. Um grupo desenvolveu um sanduíche em papel ELISA com uma gama de quantificação que durou sete ordens de magnitude (102-109 pfu/mL); no entanto, esse método necessárias várias etapas de revestimento de anticorpo e levou para um dia inteiro para o ensaio de8. Nosso grupo também desenvolveu um método de ELISA para quantificar as partículas de fago M13, mas tinha um intervalo de detecção menos sensível do 106 a de pfu/mL 1011 5. Lantanídios comutável sondas de fluorescência foram desenvolvidas para enumerar M13 e dados de quantificação podem ser obtidos dentro de 20 min; no entanto, este ensaio tem uma estreita faixa dinâmica de 109 1012 pfu/mL9. Um grupo usado microscopia de força atômica para enumerar as partículas de fago M13 em solução, mas isso requer avançados de microscopia eletrônica e trabalhou apenas dentro de uma faixa estreita de concentrações10. Outro estudo usado monodisperso emulsões para prender fluorescente fago M13 e T4 do repórter e contar fago pelo número de gotículas fluorescentes; no entanto, esta abordagem também exibiu uma gama estreita de quantificação de 102 a 10 de pfu/mL6 11. Enquanto gotículas que digital PCR tem sido utilizada para quantificar o fago M13, esta abordagem é incapaz de diferenciar entre o número de partículas de fago infecciosas e não infecciosas12.
O nosso grupo desenvolveu recentemente qPCR métodos para enumerar fago T7 e M13 identificado de biopanning contra um modelo de célula barreira sangue - cérebro usando dois diferentes repórter fluorescente tinturas5. Em comparação com métodos de quantificação acima mencionados, os métodos de qPCR desenvolvemos foram elevado-throughput e tempo-eficiente para quantificar numerosas amostras e capaz de diferenciar entre fago infeccioso e não infecciosas com DNase eu pré-tratamento da amostras do fago. Importante, esta abordagem pode reproducibly e precisão quantificar bacteriófagos M13 e T7 de biopanning amostras. Para orientar pesquisadores novatos na área do fago qPCR, aqui descrevemos um método de qPCR detalhadas para enumerar as partículas do fago T7 de uma biblioteca de cisteína-restrita (CX7C) garimpadas contra uma barreira de muco de fibrose cística (CF) em vitro . Partir deste trabalho, método de qPCR pode ser estendido para quantificar as partículas do fago de outros tipos de biopanning e de outras fontes, incluindo água, solo e fluidos corporais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Este protocolo descreve o uso do PCR quantitativo (qPCR) para enumerar fago T7 de experimentos de seleção do fago (i.e., "biopanning"). qPCR é uma abordagem baseada em fluorescência para quantificação de DNA, e aqui, é adaptado para quantificar o genoma do fago como um proxy para as partículas do fago. Neste protocolo, um método de preparação do ADN do fago facile é descrito usando o aquecimento de alta temperatura sem purificação de DNA adicional. O método só precisa de pequenos volumes do fago tratado termicamente e pequenos volumes da reação qPCR. qPCR é alta produtividade e rápido, capaz de processar e obter dados de uma placa de 96 poços de reações em 2-4 h. comparado a outras abordagens de enumeração do fago, qPCR é mais eficiente em termos de tempo. Aqui, qPCR é usado para enumerar fago T7 identificado de biopanning contra o modelo de muco da fibrose cística, como in vitro . O método de qPCR pode ser estendido para quantificar o fago T7 de outros experimentos, incluindo outros tipos de biopanning (ex., triagem de fago imobilizou o emperramento da proteína, in vivo ) e outras fontes (por exemplo, sistemas de água ou fluidos corporais). Em resumo, este protocolo pode ser modificado para quantificar qualquer vírus DNA encapsulado.

Ferramentas de design diferente da primeira demão podem ser usadas para projetar primers qPCR. Normalmente, o projeto da primeira demão programas têm seus próprios algoritmos internos para calcular e validar os parâmetros chaves do cartilhas, por exemplo, % de GC, Tm, dímero da primeira demão ou formação de grampo de cabelo, etc. em geral, os critérios-chave são semelhantes em diferentes ferramentas de projeto da primeira demão e primers podem ser projetados ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

Um tempo, preciso e reprodutível quantitativo PCR (qPCR) método eficiente para enumerar do bacteriófago T7 é descrito aqui. O protocolo descreve claramente a preparação de DNA genômica do fago, preparação de reação de PCR, qPCR ciclismo condições e análise de dados de qPCR.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Este método poderia ajudar a responder a problemas-chave nos campos de virologia e microbiologia relacionados à enumeração de bacteriófagos de amostras complexas e diagnósticos e terapêuticas baseadas em bacteriófagos. A principal vantagem desta técnica é que permite quantificação eficiente e precisa do tempo de um grande número de amostras de experimentos de biopanning phage não viáveis com ensaios tradicionais. Demonstrando o procedimento estarão Rashmi Mohanty e Jasmim Leal, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.Depois de projetar os primers e criar uma concentração de estoque, obtenha referência T7 phage DNA em uma concentração de 0,1 microgramas por microliter. Usando água ultrauso, dilui-se em série este DNA dez vezes, de um milhão de femtogramas por microliter para um femtogramas por microliter em tubos PCR de 0,2 mililitros. Prepare 20 microliters de cada concentração, certificando-se de trocar pontas de pipeta e vórtice dos tubos entre cada estágio da diluição.Em seguida, converta a concentração de DNA de referência T7 de femtogramas por microliter para cópias de genoma por microliter. Primeiro, pipetas 200 microliters da amostra T7 phage clone em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro para cada uma das 10 amostras desejadas. Adicione dois microliters de DNase um a cada tubo.Tampe os tubos e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos em um banho seco aquecido. Em seguida, incubar a 100 graus celsius por 15 minutos em um banho seco aquecido. Centrifugar os tubos contendo as pragas tratadas a calor a 18.534 vezes g durante 10 segundos.Coloque os tubos centrifugados em um misturador de vórtice definido no modo de ativação do toque por 10 segundos para misturar as pragas. Gire novamente aos 18, 534 vezes g por 10 segundos. Depois disso, deixe as amostras no banco do laboratório cerca de uma hora para esfriá-las à temperatura ambiente.Prepare a pré-mistura qPCR para 10 amostras biopanned phage de concentração desconhecida e sete amostras de concentrações padrão em triplicado. Resultando em uma pré-mistura para 51 amostras contendo 255 microlitros de mix mestre qPCR, 51 microlitros de primers e 102 microlitros de água. Aliquot oito microliters do PCR preparado misturam em 51 poços de uma placa qPCR de 96 poços.Em seguida, adicione dois microliters de amostras de phage T7 tratadas a calor a cada um desses poços, distribuindo-o abaixo da superfície da pré-mistura qPCR. Usando filme adesivo, sele a placa. Enrole a placa em papel alumínio para minimizar o branqueamento da foto fluorescência e, em seguida, prossiga para executar a placa no equipamento qPCR.Configure as condições de ciclismo e derreta as configurações da curva, conforme descrito no protocolo de texto. Após a execução do qPCR, o gráfico de amplificação, o plot de curva de fusão e o plot multicomponente são analisados a partir dos dados brutos. O plot de amplificação indica se a amplificação do PCR de cada amostra é bem sucedida ou não.O enredo multicomponente representa a amplificação e decadência do sinal fluorescente ao longo dos ciclos de amplificação. Enquanto o gráfico da curva de derretimento é usado para validar a especificidade dos primers, uma vez que cada produto PCR tem uma temperatura de fusão única. A curva padrão é então gerada a partir do DNA de referência.Aqui, a eficiência de amplificação é calculada como sendo de 92,4% Os dados representativos de um estudo qPCR são então comparados com o mesmo phage que foram quantificados por um ensaio de placa de camada dupla na faixa testada de 10 a 10 milhões de cópias de genoma por microliter. Como visto aqui, o número de phages na quantitação qPCR é maior do que no ensaio da placa. A repetibilidade do método qPCR representado pelo coeficiente de variância é vista com valores que variam de 2,85 a 27,2%.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que existem inúmeras considerações no desenvolvimento e uso do qPCR para quantificar com precisão os phages, incluindo tratamento cuidadoso e preparação de amostras e calibração de equipamentos relevantes.Seguindo este método, outras técnicas podem ser realizadas a fim de enumerar partículas de phage em uma variedade de aplicações incluídas no biopanning vivo, preparação de DNA da biblioteca phage e detecção de sequenciamento e phage de próxima geração em amostras ambientais complexas. Não se esqueça que os phages são considerados perigos biológicos em laboratório e precauções como equipamentos de proteção individual, incluindo luvas e jalecos, devem ser sempre usadas durante a realização do procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Imunologia e Infecção

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Desenvolvimento e validação de um método PCR quantitativa para equídeo herpesvírus 2 Diagnostics em fluidos respiratórios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotipagem de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribossômico Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolação e avaliação quantitativa de pilhas da escova dos Tracheas do rato

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Determinação da identidade celular imune e pureza usando PCR quantitativo baseado em epigenética

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...