Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Эта работа была поддержана стартера Грант PhRMA фонда исследований и Национальный сердца, легких и крови института национальных институтов здравоохранения предоставить под номером R01HL138251 премии.

1. грунт проектирование и анализ для геномной ДНК фага Т7
<ol><li>Праймеры дизайн для амплификации геномной ДНК фага Т7. Примечание: F (вперед) и R (реверс) грунты (см. Таблицу материалы) усилить последовательности ДНК T7 вверх по течению расположена библиотека переменной региона (<stro...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Мы разработали методы ПЦР для количественного определения геномной ДНК фага5, и здесь мы описали и адаптировать метод ПЦР для перечисления T7 бактериофаги выбран слизь CF-как барьер. Минимальная информация для публикации о количественных Real-Time PCR экспериментов (MIQE) руководящ...

Бактериофага (ФАГ) дисплей технология, разработанная Джордж Смит в 1985 году, представляет собой мощный, высок объём подход к идентификации пептид или белок лигандов против целей или рецепторов клеточной мембраны, болезни антигены, клеточных органелл или конкретных органов и тканей в последние два десятилетия1,2. Здесь случайные библиотек полипептиды или одной цепи антитела отображаются на пальто белки бактериофаги (обычно M13 или T7), и конкретные лигандов могут быть определены из панорамирование против подвижности белков в vitro или в естественных условиях биологические системы через итеративный отбора. Затем лиганды может быть в сочетании с изображений или терапевтических агентов для диагностики и лечения заболеваний3,4. Очень важно точно перечислять бактериофаги во время нескольких шагов biopanning: (1) количественно бактериофаги, привязанные к подложке и (2) для количественной оценки бактериофаги, чтобы определить, если есть обогащения с каждом раунде отбора (ФАГ обогащения указывает biopanned Фаговые сродство для целевого объекта). Текущий золотой стандарт для количественной оценки, assay металлической пластинкы-двухслойная, представляет несколько проблем; Это утомительно, громоздкой и потенциально неточным для большого числа проб. Таким образом наша группа разработала чувствительных, воспроизводимость, точной и время эффективных количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод для перечисления M13 и Т7 Фаговые частицы от biopanning5.
ПЦР является привлекательным и осуществимым методом точного количественного определения T7 и M13 бактериофаги. Поскольку каждый индивидуальный фаговых частиц может содержать только одну копию геномной ДНК (dsDNA или ssDNA), один Фаговые генома эквивалентна одной Фаговые частицы; путем определения количественных показателей числа Фаговые геномов, целесообразно определить количество бактериофаги. Во время ПЦР, флуоресцентный репортер красители привязать геномной ДНК фага неспецифически или специально через последовательность специфические праймеры во время ПЦР-амплификации и флуоресценции сигнала увеличивается с каждым раундом амплификации. Когда сигнал флуоресценции достигает порога, что раунд/цикл амплификации отмечается как порог цикла (Ct). Известной концентрации ссылка Фаговые ДНК заговор против их Ct значения для установления стандартной кривой. Использование стандартной кривой с КТ значения образцов ДНК, может путем интерполяции концентрации бактериофаги.
В то время как ранее разработаны и широко используется для количественного определения бактериофаги от biopanning многочисленные стратегии, каждая из них имеет конкретные проблемы. Метод наиболее популярных и обычных является assay металлической пластинкы двойного слоя. Здесь, принимающей бактерии заражены бактериофаги, подготовленных на серийных разведений, покрытие на подложке твердых агар и обложил с агар; Бактериофаги перечисляются с количество металлических пластинк сформирована (то есть, доска формирования подразделений или ОРП) на табличке агар. Assay металлической пластинкы чувствительных, но утомительный, длительным и неточной, особенно для многочисленных образцов и с высокой концентрации5. Кроме того энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) были адаптированы для перечисления M13 и Т7 Фаговые частицы6,,78. Здесь, связаны бактериофагов в различных разведениях и захвачен на твердом субстрате (т.е., микроплита), исследовали с ФАГ специфические антитела и обнаружить с помощью Репортеры (например, фермент чувствительных хромогенных субстратов, флуорофоров) для Определите количество фаговых частиц настоящего. Надписи (например, флюоресценция, поглощения) образцов может использоваться для количественного определения неизвестных концентрациях против Фаговые стандартов в известных концентрациях. Были разработаны различные ELISAs ФАГ основе, но они имеют потенциальные ограничения. Одна группа разработала бумажных сэндвич ELISA с диапазоном количественной оценки, которые охватывали семь порядков (102-109 ОРП/мл); Однако этот метод требует несколько шагов антитела покрытия и take up к целый день для пробирного8. Наша группа также разработала метод ИФА для количественного определения M13 Фаговые частицы, но был менее чувствительных дальность обнаружения 106 - 1011 ОРП/мл5. Переключаемый лантаноиды флуоресценции зондов были разработаны для перечисления M13 и количественной оценке данные могут быть получены в течение 20 мин; Однако, этот assay имеет узкий динамический диапазон из 109 1012 ОРП/мл9. Одна группа использовала атомно-силовой микроскопии для перечисления M13 Фаговые частицы в растворе, но это требует передовых электронной микроскопии и работал только в узком диапазоне концентраций10. Другое исследование используется монодисперсных эмульсии для улавливания флуоресцентные M13 и T4 репортер бактериофаги и рассчитывать бактериофаги, количество флуоресцентные капель; Однако, этот подход также выставлены узкие количественной оценки варьируются от 102 -106 ОРП/мл11. При этом капельки цифровой PCR были использованы для количественной оценки M13 бактериофаги этот подход не может различать количество инфекционных и неинфекционных Фаговые частицы12.
Наша группа недавно разработала методы ПЦР для перечисления T7 и M13 бактериофаги, определены от biopanning против blood - brain барьер ячеечная модель с использованием двух различных флуоресцентные репортер красителей5. По сравнению с вышеупомянутой количественной оценки методов, мы разработали методы ПЦР были высокой пропускной способности и времени эффективным количественно оценить многочисленные образцы и возможность различать инфекционных и неинфекционных бактериофаги с DNase I предварительной обработки Фаговые образцов. Важно отметить, что этот подход может можно воспроизвести и точно количественно M13 и Т7 бактериофаги от biopanning образцов. Для начинающих исследователей в области Фаговые ПЦР, здесь мы опишем подробный ПЦР метод для перечисления T7 Фаговые частицы из хвоща ограничены библиотеки (CX7C) приготовлена в vitro барьер слизь кистозный фиброз (CF). От этой работы метод ПЦР может быть продлен для количественного определения Фаговые частицы от других видов biopanning и из других источников, включая воду, почву и жидкости организма.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Этот протокол описывает использование количественного PCR (ПЦР) для перечисления T7 бактериофаги от фага выбор экспериментов (т.е., «biopanning»). ПЦР является подход, основанный на флуоресценции, для количественного определения ДНК, и здесь, он приспособлен для количественного определения Фаговые геномов как прокси для Фаговые частицы. В этом протоколе метод подготовки ДНК снисходительный Фаговые описывается с помощью высокой температуры Отопление без дополнительной очистки ДНК. Этот метод должен только небольшие объемы термообработанная бактериофаги и небольшие объемы реакции ПЦР. ПЦР высокой пропускной способностью и быстрый, возможность обработки и получения данных от 96-луночных пластины реакций в 2 – 4 ч. по сравнению с другими подходами перечисления ФАГ, ПЦР более эффективным с точки зрения времени. Здесь ПЦР используется для перечисления T7 бактериофаги от biopanning в vitro модели муковисцидоза как слизи. Метод ПЦР может быть расширен для количественного определения T7 бактериофаги от других экспериментов, включая другие виды biopanning (например., иммобилизованных связывания белков, в естественных условиях скрининг ФАГ) и другие источники (например, систем водоснабжения или жидкостями организма). Таким образом этот протокол могут быть изменены для количественного определения любых инкапсулированные ДНК вирусов.

Инструменты для конструирования праймера различные могут быть использованы для разработки ПЦР праймеры. Как правило грунтовки дизайн программы имеют свои собственные встроенные алгоритмы для расчета и проверки ключевых параметров грунты, например, GC %, ТМ, диме?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

Воспроизводимость, точность и время эффективный количественный PCR (ПЦР) метод для перечисления бактериофага Т7 описано здесь. Протокол четко описывает подготовка геномной ДНК фага, подготовка реакции PCR, Велоспорт условия ПЦР и ПЦР анализа данных.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в области вирусологии и микробиологии, связанные с перечислением бактериофагов из сложных образцов и бактериофаг на основе диагностики и терапии. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет время эффективной и точной количественной оценки большого количества образцов из фагов дисплей биопанирования экспериментов не представляется возможным с традиционными анализами. Демонстрация процедуры будет Рашми Mohanty и Jasmim Leal, аспиранты из моей лаборатории.После проектирования грунтовок и создания концентрации запасов, получить ссылку T7 фаг ДНК в концентрации 0,1 микрограмма на микролитер. Используя ультрапурную воду, последовательно разбавляйте эту ДНК в десять раз, от одного миллиона фемтограмм на микролитр до одной фемтограммы на микролитр в 0,2 миллилитровЫх ПЦР-трубках. Подготовка 20 микролитров каждой концентрации, убедившись, что изменить пипетки советы и вихрь труб между каждой стадии разбавления.Затем переобразуйте концентрацию ДНК phage T7 из фемтограмм на микролитер в копии генома на микролитер. Во-первых, пипетка 200 микролитров образца клона мага T7 в 1,5 миллилитровую микро центрифугу трубки для каждого из 10 желаемых образцов. Добавьте два микролитров DNase по одному к каждой трубке.Крышка трубки и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут в нагретой сухой ванне. Затем инкубировать при 100 градусах по Цельсию в течение 15 минут в нагретой сухой ванне. Центрифуга трубок, содержащих теплообработанные фаги на 18, 534 раз г в течение 10 секунд.Поместите центрифугированные трубки на вихревой смеситель, установленный в режиме сенсорной активации в течение 10 секунд, чтобы смешать фаги. Спин снова на 18, 534 раз г в течение 10 секунд. После этого оставьте образцы на лабораторной скамейке около часа, чтобы охладить их до комнатной температуры.Подготовь премикс qPCR для 10 биопаннефных фагов неизвестных концентраций и семь образцов стандартных концентраций в трипликате. В результате получился премикс для 51 образца, содержащий 255 микролитров мастер-микста qPCR, 51 микролитров грунтовки и 102 микролитров воды. Aliquot восемь микролитров подготовленной смеси ПЦР в 51 скважины 96-хорошо qPCR пластины.Затем добавьте два микролитров теплообработанных образцов T7 фагов к каждой из этих скважин, раздав их под поверхностью премикса qPCR. Используя клейую пленку, запечатайте пластину. Оберните пластину в алюминиевую фольгу, чтобы свести к минимуму отбеливание флуоресценции фото, а затем приступить к запуску пластины на оборудовании qPCR.Настройка условий езды на велосипеде и настройки кривой расплава, изложенные в текстовом протоколе. После запуска qPCR из необработанных данных анализируются участок усиления, участок кривой расплава и многокомпонентный участок. Участок усиления указывает, является ли усиление ПЦР каждой выборки успешным или нет.Многокомпонентный сюжет представляет собой усиление и распад флуоресцентного сигнала на протяжении всех циклов усиления. В то время как участок кривой расплава используется для проверки специфичности грунтовки, так как каждый продукт ПЦР имеет одну уникальную температуру плавления. Стандартная кривая затем генерируется из эталонной ДНК.Здесь эффективность усиления рассчитывается в размере 92,4% Репрезентативные данные исследования qPCR затем сравниваются с тем же фагом, который был количественно с помощью анализа двухслойного налета в тестемом диапазоне от 10 до 10 миллионов копий генома на микролитр. Как видно здесь, количество фагов в количественной оценке qPCR выше, чем в анализе бляшек. Повторяемость метода qPCR, представленного коэффициентом дисперсии, имеет значения от 2,85 до 27,2% При попытке этой процедуры важно помнить, что при разработке и использовании qPCR существует множество соображений для точной количественной оценки фагов, включая тщательную обработку и подготовку образцов и калибровку соответствующего оборудования.Следуя этому методу, другие методы могут быть выполнены для того, чтобы перечислить фагов частиц в различных приложениях, включенных в vivo биопанирования, фаг библиотеки ДНК подготовки и следующего поколения секвенирования и обнаружения фагов в сложных экологических образцов. Не забывайте, что фагов считаются биологическими опасностями в лаборатории и такие меры предосторожности, как средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки и лабораторные пальто, всегда следует носить во время выполнения процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Высокая пропускная способность Количественный реальном времени RT-PCR анализа для определения профилей экспрессии типов I и III интерферона подтипов

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Оптимизация количественного микро-анализ нейтрализации

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Изоляция и количественная оценка клеток кисти от мыши Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Пан-лиссавирус в режиме реального времени RT-PCR для диагностики бешенства

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Определение идентичности и чистоты иммунных клеток с использованием эпигенетических основе количественных ПЦР

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Локализация и количественная оценка бегомовирусов в тканях Whitefly с помощью иммунофлуоресценции и количественного ПЦР

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...