Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por beca de PhRMA Foundation investigación arranque y el National Heart, Lung and Blood Institute de los institutos nacionales de salud otorgan el número de concesión R01HL138251.

1. primer diseño y análisis de ADN genómico de fago T7
<ol><li>Diseño de cebadores para la amplificación de la DNA genomic de fago T7. Nota: F (delantero) y R (reversa) cartillas (véase Tabla de materiales) amplifican la secuencia de la DNA T7 situado aguas arriba de la región variable de la biblioteca (figura 1).</li>
	<li>Elegir un analizador de la cartilla apropiada para evaluar los parámetros de los iniciadores, incluyendo punto de fusión (Tm), por ciento c...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. 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R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. 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A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Desarrollamos métodos de qPCR para cuantificar phage genoma ADN5y aquí describimos y adaptado un método de qPCR para enumerar T7 phages seleccionados contra una barrera de moco similar a CF. Información mínima para las directrices de publicación de cuantitativa en tiempo real PCR experimentos (MIQE) fueron adaptados para desarrollar y validar el método de qPCR para enumeración de fagos T715. El protocolo que hemos desarrollado para cuantificar los phages de biopanni...

Tecnología de visualización de bacteriófagos (fagos), desarrollada por George Smith en 1985, es un enfoque potente y alto rendimiento para identificar péptidos o proteínas ligandos contra objetivos o receptores de la membrana celular, antígenos de la enfermedad, organelos celulares o específicos órganos y tejidos en los últimos dos décadas1,2. Aquí, al azar bibliotecas de polipéptidos o anticuerpos de cadena simple se muestran en las proteínas de la capa de phages (típicamente M13 o T7) y ligandos específicos pueden ser identificados de bateo contra proteínas inmovilizadas en vitro o en vivo sistemas biológicos a través de un proceso iterativo de selección. Entonces, los ligandos pueden ser juntados con agentes terapéuticos o proyección de imagen para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades3,4. Es importante enumerar con precisión los phages durante varios pasos de biopanning: (1) cuantificar fagos que se unen al sustrato y (2) cuantificar los phages para determinar si hay enriquecimiento con cada ronda de selección (enriquecimiento phage indica biopanned afinidad de fagos para el destino). El estándar de oro actual para la cuantificación, ensayo de placa de doble capa, presenta múltiples desafíos; es tedioso, engorroso y potencialmente inexacto para un gran número de muestras. Por lo tanto, nuestro grupo ha desarrollado un método de (qPCR) la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa sensible, reproducible, precisa y eficiente para enumerar las partículas de fago M13 y T7 de biopanning5.
qPCR es un método atractivo y factible de cuantificar con precisión fagos T7 y M13. Puesto que cada partícula de fago individual sólo puede contener una copia de la DNA genomic (dsDNA o ssDNA), un genoma phage es equivalente a una partícula de fago; al cuantificar el número de genomas de fagos, es posible cuantificar el número de fagos. Durante qPCR, reportero fluorescente tintes atan phage de la DNA genomic no específicamente o específicamente a través de cebadores específicos de secuencia durante la amplificación por PCR y la fluorescencia señal aumenta con cada ronda de amplificación. Cuando la señal de fluorescencia alcanza el umbral, que ronda/ciclo de amplificación se observa como el ciclo umbral (Ct). Las concentraciones conocidas de fago ADN de referencia se trazan contra sus valores de Ct para establecer una curva estándar. Usando la curva estándar con los valores de Ct de muestras de ADN, las concentraciones de fagos pueden ser interpoladas.
Mientras que numerosas estrategias han sido previamente desarrollados y ampliamente utilizado para cuantificar los phages de biopanning, cada uno de ellos tiene retos específicos. El método más popular y convencional es el ensayo de placa de doble capa. Aquí, host bacterias infectan con phages preparados en diluciones seriadas, se platean en un sustrato de agar sólido y son overlaid con agar; los phages son enumerados con el número de las placas formadas (es decir, unidades formadoras de placa o pfu) en la placa de agar. Ensayo de placa es sensible pero tedioso, lento e inexacto, especialmente para muestras numerosas y con altas concentraciones de5. Además, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) han sido adaptados para enumerar M13 y T7 fagos partículas6,7,8. Aquí, están obligados los phages en diferentes diluciones y capturado en un sustrato sólido (es decir, una microplaca), sondeado con anticuerpos específicos del fago y detectado usando Reporteros (p. ej., enzimas sustratos cromogénicos sensible, fluoróforos) para determinar el número de partículas de fago presente. Las lecturas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia) de muestras pueden utilizarse para cuantificar las concentraciones desconocidas contra estándares de fago en concentraciones conocidas. Se han desarrollado ELISAs basados en fagos diferentes pero tienen limitaciones potenciales. Un grupo desarrolló un sándwich en papel ELISA con un rango de cuantificación que abarcó siete órdenes de magnitud (102-109 pfu/mL); sin embargo, este método requiere varios pasos de la capa de anticuerpo y tomó hasta un día entero para el ensayo8. Nuestro grupo también desarrolló un método de ELISA para cuantificar las partículas de fago M13 pero tenía un alcance de detección menos sensible de 106  1011 pfu/mL5. Han desarrollado sondas de fluorescencia de lantánido conmutable para enumerar M13 y podrían obtenerse datos de cuantificación dentro de 20 minutos; sin embargo, este ensayo tiene un rango dinámico estrecho de 109 1012 pfu/mL9. Un grupo utilizó microscopía de fuerza atómica enumerar las partículas de fago M13 en solución, pero esto requiere microscopia electrónica avanzada y sólo trabajó dentro de un estrecho rango de concentraciones10. Otro estudio utilizado emulsiones monodispersa phages de reportero fluorescentes M13 y T4 y phages de la cuenta por el número de gotas fluorescentes; sin embargo, este enfoque también exhibió una gama estrecha de la cuantificación de 102 106 pfu/mL11. Mientras gota que PCR digital se ha utilizado para cuantificar los phages M13, este enfoque es incapaz de distinguir entre el número de partículas de fago infecciosas y no infecciosas12.
Nuestro grupo ha desarrollado métodos de qPCR para enumerar fagos T7 y M13 identificadas biopanning contra un modelo de celular de la barrera blood - brain con dos diferentes reportero fluorescente tintes5. Comparado con métodos de cuantificación ya mencionado, los métodos de qPCR desarrollamos fueron alto rendimiento y tiempo-eficiente para cuantificar muestras numerosas y capaces de diferenciar entre phages infecciosos y no infecciosas con DNasa I tratamiento previo de la muestras de fago. Lo importante, este enfoque puede reproducible y precisa cuantificar bacteriófagos M13 y T7 de muestras biopanning. Para guiar a los investigadores noveles en el área de qPCR de fago, aquí se describe un método detallado de qPCR para enumerar las partículas de fago T7 en una biblioteca con restricciones de cisteína (CX7C) panorámica contra una barrera de moco en vitro la fibrosis quística (FQ). De este trabajo, método de qPCR puede ampliarse para cuantificar las partículas de fago de otros tipos de biopanning y de otras fuentes, incluyendo agua, suelo y fluidos corporales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Este protocolo describe el uso de la PCR cuantitativa (qPCR) para enumerar fagos T7 de experimentos de selección de fagos (es decir, "biopanning"). qPCR es un enfoque basado en la fluorescencia para cuantificar ADN, y aquí, se adapta a cuantificar genomas de fagos como proxy para las partículas de fago. En este protocolo, se describe un método de preparación de DNA de fago fácil usando calefacción de alta temperatura sin purificación adicional de ADN. El método sólo necesita pequeñas cantidades de phages tratada térmicamente y volúmenes pequeños de la reacción de la qPCR. qPCR es alto rendimiento y rápido, capaz de procesar y obtener los datos de una placa de 96 pocillos de reacciones en 2 – 4 h. en comparación a otros métodos de enumeración de fagos, qPCR es más eficiente en tiempo. Aquí, qPCR se utiliza para enumerar fagos T7 identificadas biopanning contra vitro moco de la fibrosis quística como modelo. El método de qPCR puede ampliarse para cuantificar fagos T7 de otros experimentos, incluyendo otros tipos de biopanning (e.g., proyección de fago inmovilizada la Unión a proteínas, in vivo ) y otras fuentes (por ejemplo, los sistemas de agua u otros líquidos corporales). En Resumen, este protocolo puede modificarse para cuantificar cualquier virus ADN encapsulado.

Herramientas de diseño de la cartilla diferentes pueden utilizarse para diseñar primers qPCR. Por lo general, primer diseño programas tienen sus propios incorporados algoritmos para calcular y validar los parámetros clave de cartillas, por ejemplo, GC %, Tm, dimer de cartilla o formación de horquilla, etc. generalmente, los criterios claves son similares en diferentes herramientas de diseño de la cartilla y cartillas pueden diseñarse siguiendo sus instrucciones. P...

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Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

Reproducible, exacto y tiempo eficiente cuantitativo PCR (qPCR) describe un método para enumerar bacteriófago T7 es aquí. El protocolo describe claramente la preparación de ADN genómico de fago, preparación de reacción de PCR, qPCR ciclismo condiciones y análisis de datos qPCR.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Este método podría ayudar a responder a problemas clave en los campos de virología y microbiología relacionados con la enumeración de bacteriófagos a partir de muestras complejas y diagnósticos y terapias basados en bacteriófagos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la cuantificación eficiente y precisa del tiempo de un gran número de muestras de experimentos de biopanning de la pantalla de fagos no es factible con los ensayos tradicionales. Demostrando el procedimiento serán Rashmi Mohanty y Jasmim Leal, estudiantes graduados de mi laboratorio.Después de diseñar las imprimaciones y crear una concentración de stock, obtenga ADN de fago T7 de referencia a una concentración de 0,1 microgramos por microlitro. Usando agua ultrapura, diluir en serie este ADN diez veces, de un millón de femtogramas por microlitro a un femtogramas por microlitro en tubos PCR de 0,2 mililitros. Preparar 20 microlitros de cada concentración, asegurándose de cambiar las puntas de la pipeta y el vórtice de los tubos entre cada etapa de la dilución.A continuación, convierta la concentración de ADN de referencia de phage T7 de femtogramas por microlitro en copias del genoma por microlitro. En primer lugar, pipetear 200 microlitros del clon de fago T7 de muestra en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros para cada una de las 10 muestras deseadas. Agregue dos microlitros de DNase uno a cada tubo.Tapa los tubos e incuba a 37 grados centígrados durante 10 minutos en un baño seco calentado. Luego incubar a 100 grados centígrados durante 15 minutos en un baño seco caliente. Centrifugar los tubos que contienen los fagos tratados térmicamente a 18, 534 veces g durante 10 segundos.Coloque los tubos centrifugados en un mezclador de vórtice en modo de activación táctil durante 10 segundos para mezclar los fagos. Gire de nuevo a 18, 534 veces g durante 10 segundos. Después de esto, deje las muestras en el banco del laboratorio alrededor de una hora para enfriarlas a temperatura ambiente.Preparar la premezcla qPCR para 10 muestras de fago biopanned de concentración desconocida y siete muestras de concentraciones estándar en triplicado. Resultando en una premezcla para 51 muestras que contienen 255 microlitros de mezcla maestra qPCR, 51 microlitros de imprimadores y 102 microlitros de agua. Aliquot ocho microlitros de la mezcla de PCR preparada en 51 pozos de una placa qPCR de 96 pozos.A continuación, añada dos microlitros de muestras de fagos T7 tratadas térmicamente a cada uno de estos pozos, dispensando por debajo de la superficie de la premezcla qPCR. Con película adhesiva, selle la placa. Envuelva la placa en papel de aluminio para minimizar el blanqueo fotográfico por fluorescencia y luego proceda a ejecutar la placa en el equipo qPCR.Configure las condiciones de ciclo y los ajustes de curva de fusión como se describe en el protocolo de texto. Después de ejecutar el qPCR, la gráfica de amplificación, la gráfica de curva de fusión y la gráfica multicomponente se analizan a partir de los datos sin procesar. La gráfica de amplificación indica si la amplificación de PCR de cada muestra es correcta o no.La gráfica multicomponente representa la amplificación y la descomposición de la señal fluorescente a lo largo de los ciclos de amplificación. Mientras que la gráfica de la curva de fusión se utiliza para validar la especificidad de las imprimaciones, ya que cada producto PCR tiene una temperatura de fusión única. A continuación, la curva estándar se genera a partir del ADN de referencia.Aquí se calcula que la eficiencia de amplificación es de 92,4% Datos representativos de un estudio qPCR se comparan entonces con el mismo fago que se cuantificó mediante un ensayo de placa de doble capa en el rango probado de 10 a 10 millones de copias del genoma por microlitro. Como se ve aquí, el número de fagos en la cuantificación qPCR es mayor que en el ensayo de placa. La repetibilidad del método qPCR representado por el coeficiente de varianza se considera que tiene valores que van desde 2.85 a 27.2%Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay numerosas consideraciones en el desarrollo y uso de qPCR para cuantificar con precisión los fagos, incluyendo el tratamiento cuidadoso y la preparación de muestras y calibración de equipos relevantes.Siguiendo este método, se pueden realizar otras técnicas para enumerar partículas de fagos en una variedad de aplicaciones incluidas en biopanning in vivo, preparación de ADN de biblioteca de fagos y secuenciación de próxima generación y detección de fagos en muestras ambientales complejas. No olvide que los fagos se consideran riesgos biológicos en el laboratorio y las precauciones tales como equipos de protección personal, incluyendo guantes y abrigos de laboratorio, siempre deben usarse durante la realización del procedimiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Investigación

Inmunología e Infección

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotipado de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; por Ribosómica espaciador de PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Aislamiento y evaluación cuantitativa de células de pincel de tráqueas de ratón

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Determinación de la identidad y pureza de las células inmunitarias mediante PCR cuantitativo basado en epigenética

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Localización y cuantificación de begomovirus en tejidos de mosca blanca por inmunofluorescencia y PCR cuantitativa

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...