Name: quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Detta arbete stöds av PhRMA Foundation forskningsbidrag Starter och den nationella hjärta, lungor och blod Institute of National Institutes of Health bevilja under award nummer R01HL138251.

1. primer Design och analys för T7 Phage genomiskt DNA
<ol><li>Design primers för förstärkning av T7 phage genomiskt DNA. Obs: F (framåt) och R (omvänd) primers (se Tabell för material) förstärka T7 DNA-sekvensen ligger uppströms i regionen bibliotek variabel (figur 1).</li>
	<li>Välja en lämplig primer analyzer att utvärdera parametrar av primers, inklusive smälttemperatur (Tm), procent GC innehåll (GC %), primer dimerer, hårnål bildandet och PCR lämp...

<ol>
	<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fusion+phage:+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface.">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li><li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Display+technologies:+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents.">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li><li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+phage+display:+Integrating+and+comparing+available+molecular+tools+to+enable+costeffective+high-throughput+analysis.">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li><li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR.">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li><li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA.">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li><li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage.">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li><li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR.">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li><li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminm&#228;ki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes.">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li><li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li><li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions.">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li><li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR.">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li><li>. T7Select&#174; Biopanning Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit</a> (2018)</li><li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Regression+Analysis.">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches &#196;rzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li><li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR.">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li><li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR.">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li><li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR.">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li><li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+phage+particles+isolated+from+human+feces+and+induced+from+clinical+bacterial+isolates.">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li><li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro,+Oropouche,+and+oropouche-like+viruses.">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR.">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li><li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments.">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li><li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure:+A+Kinetic+Study.">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li></ol>

Vi utvecklat qPCR metoder för att kvantifiera phage genomisk DNA5och här vi beskrivit och anpassas en qPCR metod för att räkna upp T7 fagocyt markerat mot CF-liknande slem barriär. Minsta Information för offentliggörande av kvantitativa Real-Time PCR-experiment (MIQE) riktlinjer anpassades för att utveckla och validera metoden qPCR för uppräkning av T7 fagocyt15. Det protokoll som vi utvecklat för att kvantifiera fagocyt från biopanning experiment är en tidseff...

Bacteriophage (fag) displayteknik, utvecklad av George Smith 1985, är en kraftfull, hög genomströmning metod att identifiera peptid eller protein ligander mot mål eller receptorer från cellmembranet, antigener, cellulära organeller eller specifika organ och vävnader i senaste två decennierna1,2. Här random bibliotek av polypeptider eller enda kedja antikroppar visas på pälsen proteiner av Fager (vanligtvis M13 eller T7) och specifika ligander kan identifieras från panorering mot immobiliserade proteiner in vitro- eller in vivo biologiska system genom en iterativ urvalsprocess. Ligander kan sedan kopplas till imaging eller terapeutiska agens för diagnos och behandling av sjukdomar3,4. Det är viktigt att noggrant räkna upp Fager under flera steg av biopanning: (1) för att kvantifiera Fager som binder till underlaget och (2) för att kvantifiera fagocyt för att avgöra om det finns berikning med varje omgång av urval (phage anrikning indikerar biopanned phage affinitet för målet). Nuvarande guldmyntfoten för kvantifiering, dubbla lager plack assay, presenterar flera utmaningar; Det är tråkiga, besvärliga och potentiellt felaktiga för ett stort antal prover. Vår grupp har därför utvecklat en känslig, reproducerbara, korrekt och tidseffektiv kvantitativa polymerase chain reaktion (qPCR) metod för att räkna upp M13 och T7 phage partiklar från biopanning5.
qPCR är en attraktiv och genomförbar metod att exakt kvantifiera T7 och M13 Fager. Eftersom varje enskild phage partikel kan endast innehålla en kopia av genomisk DNA (dsDNA eller ssDNA), är en phage genomet motsvarande en phage partikel; kvantifiera antalet phage genomen, är det möjligt att kvantifiera antalet Fager. Under qPCR, fluorescerande reporter färgämnen binder phage genomiskt DNA icke-specifikt eller särskilt genom sekvens-specifika primers under PCR-amplifiering, och fluorescensen signal ökar med varje runda av förstärkning. När fluorescens signalen når tröskeln, som runda/cykel av förstärkning noteras som tröskel cykeln (Ct). De kända koncentrationerna av referens phage DNA ritas mot sin Ct-värden att upprätta en standardkurva. Med standardkurvan med Ct värdena av DNA-prover, kan koncentrationerna av fagocyt interpoleras.
Medan många strategier har tidigare utvecklats och i stor utsträckning använts för att kvantifiera fagocyt från biopanning, har alla av dem särskilda utmaningar. Den mest populära och konventionella metoden är dubbla lager plack assay. Här, värd bakterier är infekterade med fagocyt beredd på seriespädningar, är pläterade på en solid agar substrat och överdras med agar; Fager är uppräknade med antalet plack bildas (dvs plack bildar enheter eller pfu) på en agarplatta. Plack-analysen är känslig men tråkiga, tidskrävande och felaktig, särskilt för många prover och med höga koncentrationer5. Dessutom har enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) anpassats till räkna upp M13 och T7 phage partiklar6,7,8. Här, Fager på olika spädningar är bundna och fångas på ett fast underlagsmaterial (dvs. en mikroplattan), utforskad med phage-specifika antikroppar och påvisas med hjälp av reportrar (t.ex. enzymet känsliga kromogent substrat, fluorophores) till bestämma antalet phage partiklar. Avläsning (t.ex. fluorescens, absorbans) prover kan användas för att kvantifiera okända koncentrationer mot phage standarder på kända koncentrationer. Olika phage-baserade Elisatest har utvecklats men de har potentiella begränsningar. En grupp utvecklat en pappersbaserade sandwich-ELISA med en kvantifiering utbud som sträcker sig över sju tiopotenser (102-109 pfu/mL); men denna metod krävs flera steg av antikropp beläggning och tog upp till en hel dag för assay8. Vår grupp också utvecklat en ELISA-metod för att kvantifiera M13 phage partiklar men hade en mindre känsliga detekteringsområde 106 till 1011 pfu/mL5. Omkopplingsbar lanthanide fluorescens sonder har utvecklats för att räkna upp M13 och kvantifiering uppgifter kunde erhållas inom 20 min; denna analys har dock ett smalt dynamiska omfång med 109 1012 pfu/mL9. En grupp används atomic force microscopy att räkna upp M13 phage partiklar i lösning, men detta kräver avancerad elektronmikroskopi och bara arbetat inom ett snävt intervall av koncentrationer10. En annan studie används monodisperse emulsioner att fälla fluorescerande M13 och T4 reporter fagocyt och räkna fagocyt av antalet fluorescerande droppar; dock detta tillvägagångssätt också uppvisade ett smalt kvantifiering utbud från 102 106 pfu/mL11. Samtidigt droplet digital PCR har använts för att kvantifiera M13 fagocyt, är detta tillvägagångssätt inte kan skilja mellan antalet smittsamma och icke-infektiös phage partiklar12.
Vår grupp har nyligen utvecklat qPCR metoder för att räkna upp T7 och M13 fagocyt identifierade från biopanning mot en blod - hjärnbarriären cell modell med två olika fluorescerande reporter färgämnen5. Jämfört med tidigare nämnda kvantifiering metoder, qPCR metoder vi utvecklat var hög genomströmning och tidseffektivt att kvantifiera många prover och kunna skilja mellan smittsamma och icke-infektiös fagocyt med DNAS jag förbehandling av den phage prover. Detta tillvägagångssätt kan allt reproducibly och exakt kvantifiera M13 och T7 bakteriofager från biopanning prover. För att vägleda nybörjare forskare i området i phage qPCR, beskriver här vi en detaljerad qPCR metod för att räkna upp T7 phage partiklar från ett cystein-constrained bibliotek (CX7C) panoreras mot en slem i vitro cystisk fibros (CF) barriär. Från detta arbete, kan qPCR metod utvidgas till att kvantifiera phage partiklar från andra typer av biopanning och från andra källor, inklusive vatten, jord och kroppsvätskor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for T7 genomic DNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG 
			R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select packaging control DNA</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>69679-1UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4313663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7Select 415-1 Cloning Kit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>70015</td>
			<td>User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4453535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 21 Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Model:2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1 Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75003624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio Real-time PCR software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>v1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time qPCR primer design</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative pcr of t7 bacteriophage from biopanning

Det här protokollet beskriver användningen av kvantitativ PCR (qPCR) att räkna upp T7 fagocyt från phage urval experiment (dvs, ”biopanning”). qPCR är en fluorescens-baserad metod för att kvantifiera DNA, och här är det anpassat till kvantifiera phage genomen som en proxy för phage partiklar. I detta protokoll beskrivs en lättköpt phage DNA förberedelse metod med hög temperatur värme utan ytterligare DNA-rening. Metoden behöver bara små volymer av värmebehandlad fagocyt och små volymer av qPCR reaktionen. qPCR är hög genomströmning och snabb, bearbeta och få data från en plattan med 96 brunnar av reaktioner i 2 – 4 h. jämfört med andra phage uppräkning synsätt, qPCR är mer tidseffektivt. Här används qPCR att räkna upp T7 fagocyt identifierade från biopanning mot i vitro cystisk fibros-liknande slem modell. Metoden qPCR kan utvidgas till att kvantifiera T7 fagocyt från andra experiment, inklusive andra typer av biopanning (t.ex., orörlig proteinbindning, invivo phage screening) och andra källor (t.ex. vattensystem eller kroppsvätskor). Sammanfattningsvis kan detta protokoll ändras för att kvantifiera eventuella DNA-inkapslade virus.

Olika primer designverktyg kan användas för att utforma qPCR primers. Typiskt, primer design program har sina egna inbyggda algoritmer för att beräkna och verifiera de centrala parametrarna av primers, t.ex., GC %, Tm, primer dimer eller hårnål bildandet, etc. allmänt, de centrala kriterierna är liknande i olika primer designverktyg och primers kan utformas efter deras instruktioner. Primer BLAST kan användas för att bekräfta specificiteten av primers. En prim...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning at JoVE.com

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage från Biopanning

En reproducerbar, korrekt och tid effektiv kvantitativ PCR (qPCR) metod att räkna upp T7 bacteriophage beskrivs här. Protokollet beskrivs tydligt phage genomisk DNA förberedelse, PCR-reaktion förberedelse, qPCR cykling villkor och qPCR dataanalys.

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga problem inom virologi och mikrobiologi områden relaterade till uppräkning av bakteriofafer från komplexa prover och bakteriofage baserad diagnostik och therapeutics. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör tidseffektiv och exakt kvantifiering av ett stort antal prover från fagen visa biopanning experiment inte genomförbart med traditionella analyser. Demonstrera förfarandet kommer att Rashmi Mohanty och Jasmim Leal, doktorander från mitt laboratorium.Efter att ha konstruerat primers och skapa en lagerkoncentration, erhålla referens T7 fagi DNA vid en koncentration av 0,1 mikrogram per mikroliter. Med hjälp av ultrarent vatten, seriellt späd detta DNA tiofaldigt, från en miljon femtogram per mikroliter till ett femtogram per mikroliter i 0,2 milliliter PCR-rör. Förbered 20 mikroliter av varje koncentration, se till att byta pipettspetsar och vortexa rören mellan varje steg av utspädningen.Konvertera sedan T7-phage referens DNA-koncentrationen från femtogram per mikroliter till genomet kopior per microliter. Först pipettera 200 mikroliter av provet T7 fagen klon i en 1,5 milliliter mikro centrifugrör för vart och ett av de 10 önskade proverna. Lägg till två mikroliter av DNase en till varje rör.Kapa rören och inkubera i 37 grader Celsius i 10 minuter i ett uppvärmt torrt bad. Sedan inkubera vid 100 grader celsius i 15 minuter i ett uppvärmt torrt bad. Centrifugera de rör som innehåller de värmebehandlade fagerna vid 18, 534 gånger g i 10 sekunder.Placera centrifugerade rören på en vortexblandare inställd vid aktiveringsläget touch i 10 sekunder för att blanda fagerna. Snurra igen vid 18, 534 gånger g i 10 sekunder. Efter detta lämnar du proverna på laboratoriebänken ungefär en timme för att kyla dem till rumstemperatur.Förbered qPCR-premixen för 10 biopanneda fagenprover av okänd koncentration och sju prover av standardkoncentrationer i tre exemplar. Resulterar i en premix för 51 prover som innehåller 255 mikroliter av qPCR master mix, 51 mikroliter av primers och 102 mikroliter vatten. Aliquot åtta mikroliter av den beredda PCR blanda i 51 brunnar av en 96-väl qPCR platta.Nästa lägga till två mikroliter av värmebehandlade T7 famnprover till var och en av dessa brunnar, dispensering det under ytan av qPCR premix. Med hjälp av självhäftande film, försegla plattan. Linda plattan i aluminiumfolie för att minimera fluorescens foto blekning och fortsätt sedan att köra plattan på qPCR utrustning.Ställ in cykelförhållandena och inställningarna för smältkurvan enligt textprotokollet. Efter att qPCR har körts analyseras förstärkningsriten, ritytan för smältkurvan och multicomponent från rådata. Förstärkningsytret anger om PCR-förstärkningen av varje prov lyckas eller inte.Den multicomponent täppan föreställer förstärkningen och förfallet av det fluorescerande signalerar alltigenom förstärkningen cyklar. Medan smältkurvan tomten används för att validera specificiteten hos primers, eftersom varje PCR produkt har en unik smälttemperatur. Standardkurvan genereras sedan från referens-DNA: t.Här beräknas förstärkningseffektiviteten vara 92,4%Representativa data från en qPCR-studie sedan jämfört med samma fagen som kvantifierades av en dubbelt lager plackanalys på det testade intervallet 10 till 10 miljoner genomkopior per mikroliter. Som sett här, antalet fagen i qPCR quantitation är högre än i plakett analysen. QPCR-metodens repeterbarhet som representeras av varianskoefficienten anses ha värden som sträcker sig från 2,85 till 27,2 %När man försöker med detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att det finns många överväganden i utvecklingen och användningen av qPCR för att exakt kvantifiera fagen, inklusive noggrann behandling och beredning av prover och kalibrering av relevant utrustning.Efter denna metod kan andra tekniker utföras för att räkna upp fagpartiklar i en mängd olika tillämpningar som ingår i vivo biopanning, phage library DNA-preparering och nästa generations sekvensering och fagdetektion i komplexa miljöprover. Glöm inte att fagen anses vara biologiska faror i laboratoriet och försiktighetsåtgärder såsom personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och labbrockar, bör alltid bäras när du utför proceduren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ avbildning av Lineage-specifika Toll-like receptor-medierad signalering i monocyter och dendritiska celler från små Prover av blod

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

genotypning av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; vid Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Optimering av en kvantitativ Micro-neutraliseringstest

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

Isolering och kvantitativ utvärdering av pensel celler från mus Tracheas

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR för rabies diagnos

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Determination of Immune Cell Identity and Purity Using Epigenetic-Based Quantitative PCR

Bestämning av immuncellsidentitet och renhet med epigenetiska kvantitativa PCR

Immune cell subtype population frequencies can have a large effect on the efficacy of T cell therapies. Current methods, like flow cytometry, have ...

Localization and Quantification of Begomoviruses in Whitefly Tissues by Immunofluorescence and Quantitative PCR

Lokalisering och kvantifiering av begomovirus i Whitefly Vävnader av Immunofluorescens och kvantitativ pcr

Begomoviruses (genus Begomovirus, family Geminiviridae) are transmitted by whiteflies of the Bemisia tabaci complex in a persistent, circulative manner. ...