Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

أعمال مختبرنا بتمويل من منحة من ذ Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (مبرزين 219893) إلى سمثس. وأيد هذه البحوث أيضا على زمالة منحته مبرزين والنظام ناسيونال دي إينفيستيجادوريس (4422) إلى رجبك (رقم 37938). يشكر المؤلفون سيتي لاستخدام منشآتها أثناء كتابة هذه المخطوطة. يتم توسيع شكر خاص إلى الدكتور فيكتور مانويل غونزاليس مندوزا لجميع التوصيات في قسم البيولوجيا الجزيئية وفالنتين مندوزا رودريغيز، والمؤسسة المالية الدولية، وجامعة المكسيك الوطنية المستقلة للمرافق أثناء تصوير هذه المادة.

1-الكافيين الاستخراج في "تعليق خلية" من آرابيكا جيم- ل.
<ol><li>استخدام تعليق خلية آرابيكا جيم- 9. المحافظة على أن الإيقاف بثقافات فرعية مرة كل أسبوعين في المتوسط موراشيجي وسكوغ في pH 4.3 مع ثابت 100 لفة في الدقيقة تهتز عند 25 درجة مئوية تحت ضوء مستمر (8.3 واط/م2).</li>
	<li>حصاد ا...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

نحن الحاضرين هنا الظروف المثلى لتقييم محتوى الكافيين، CS مستويات النشاط ومحاضر في في المختبر النباتية زراعة الأنسجة، مثل تعليق خلية من آرابيكا جيم. التقارير السابقة قد أكد أن الحفاظ على الخلايا تحت إشعاع الضوء وحضور الثيوبرومين في الأجلين المتوسط وثقافة المعايير المناسبة لزياد...

الكافيين هو المستقلب ثانوية التي يتم بيوسينثيسيزيد من نباتات جنس كوفا1. هذا قلويد ينتمي إلى أسرة زانتين، وهو يعتبر هو دفاع عن مصنع الكيميائي نظراً لأنها يمكن أن تعمل ضد الآثار السلبية للعوامل الممرضة واكلات العشب2،3. وبالإضافة إلى ذلك، هذا المستقلب المسؤول عن خصائص محفزة لشرب القهوة، الذي هو عادة المستهلكة في العالم4،5. بسبب خصائصه، مجموعات بحثية عديدة مهتمة بدراسة مسار السكروز وتقويض الكافيين6،7. حاليا، يعمل المصنع في المختبر الثقافات الخلية/الأنسجة كبديل لتقييم الكافيين تراكم تحت مختلف الاستراتيجيات الحيوية وغير الحيوية8،9.
الكافيين الحيوي ينطوي على إطلاق سراح 7-زانتين هيدروليكي من نوكليوزيد الريبوز المقابلة متبوعاً بأمر N-ميثيليشنز في مناصب 3 و 1. -Adenosyl قمحددة ميثيونين (SAM)-تعتمد N-ميثيلترانسفيراسي (NMT) يحفز مثلايشن الموضع 7، بينما الثيوبرومين synthase (TS) و CS تشارك في 3-و 1-ميثيليشنز، على التوالي، إنتاج الثيوبرومين و الكافيين. وقد أتاح دراسة الجينات ترميز نمتس متميزة فهم الآلية التي ينظم الكافيين إنتاج10،11. خدمات العملاء، والذي ن-ميثيلترانسفيراسي النشاط، يحفز الأخيرين خطوات مسار السكروز من الكافيين11. في شتلات أشجار البن، فقد ثبت أن الإشعاعات الخفيفة يمكن زيادة النشاط CS، مما يؤدي إلى زيادة في التركيب الحيوي الكافيين. في الآونة الأخيرة، واظهرنا أن الحفاظ على تعليق خلية من آرابيكا C. L. تحت إشعاع الضوء هو الشرط الأمثل لتقييم الآثار التي تنتج عوامل الإجهاد اللاأحيائية المؤثرة في مسار السكروز من الكافيين8. المعلومات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات قد التطبيقات في علم الأحياء الهندسة ونظم الأيضية لتعظيم دراسة مسار السكروز الكافيين في هذه النظم في المختبر .
بالنظر إلى المزايا للحصول على نموذج مناسب لدراسة التركيب الحيوي الكافيين، نحن الأمثل شروط استخراج الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- ل. كما أنه من الممكن لوضع بروتوكول مفيدة لدراسة النشاط الأنزيمي، فضلا عن الخطوات المنهجية لتقييم مستوى الجينات محاضر كوفا الكافيين synthase 1 (CCS1) الترميز هذا الإنزيم. وهنا، نحن تقرير بروتوكول لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية آرابيكا جيم- كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وقياس كثافة (TLC-قياس كثافة).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

الكافيين (1,3,7-تريميثيلكسانثيني) قلويد البيورين في المشروبات شعبية مثل القهوة والشاي. ويعتبر هذا المستقلب الثانوية دفاع كيميائية لأنها نشاط الميكروبات وتعتبر مبيد حشري طبيعي. يمكن أن تنتج من الكافيين أيضا الآثار السلبية المانعة لمنع نمو النباتات المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، الناس في جميع أنحاء العالم تستهلك الكافيين لإثارة مسكن ومحفزة. سبب الاهتمام بالتطبيقات التكنولوجية من الكافيين، ازداد البحث في مسار السكروز من هذا المركب. هذه الدراسات قد ركزت أساسا على فهم الآليات الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم تخليق الحيوي الكافيين. وقد أصبحت زراعة الأنسجة في المختبر نظام مفيد لدراسة هذا المسار السكروز. هذه المادة سوف تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحديد الكمي للكافيين وقياس مستويات نسخة من الجينات (CCS1) ترميز الكافيين synthase (CS) في تعليق خلية L. C. آرابيكا ، فضلا عن نشاطها.

تم تحليل مقتطفات من الكافيين التي تم الحصول عليها عن طريق عملية المعروضة هنا بقياس كثافة TLC بإخضاع العينات للوحة اللوني وفقا للمخطط المبين في الشكل 1. لقياس مستويات الكافيين في مقتطفات الخلية، ومنحني بتركيزات مختلفة من المعايير التجارية لهذا المجمع كان ي...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

ويصف هذا البروتوكول وضع منهجية فعالة لاستخراج وتحديد كمية الكافيين في تعليق خلية للأم آرابيكا جيم- وهي عملية تجريبية لتقييم النشاط الأنزيمي من الكافيين synthase مع مستوى التعبير الجين الذي يشفر هذا الإنزيم.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الكيمياء التحليلية والكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية. مثل, ما هي التغييرات التي تحدث في التركيب الحيوي الكافيين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية، هو أنه يمكن تطبيقها على نماذج النباتات إينفيترو التي تنتج الكافيين.للبدء، إضافة 10 ملليلتر من الأسيتون إلى الخلايا الليسية، وختم القارورة قبل الاختلاط مع خلاط دوامة لمدة 30 ثانية. ثم اخلط العينة عند 100 دورة في الدقيقة مع دوار لمدة خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إعادة تعليق العينة مع 25 ميكروليتر من الأسيتون.أولاً، ضعي ميكرولتر واحد من مستخلص الكافيين المعد مسبقًا على ألواح هلام السيليكا. ثم, تطوير TLC في غرفة الكروماتوغرافيا مع 10 ملليلتر من المرحلة المتنقلة, الأسيتون السيكلوهيكسان. تصور عصابات الكافيين في الأشعة فوق البنفسجية قصيرة الطول الموجي، مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية المدمجة.بعد ذلك، كمي مستويات الكافيين حسب قياس الكثافة في 273 نانومتر. باستخدام ورقة التصفية، فراغ تصفية تعليق الخلية المعدة مسبقا. ثم، استخدام هاون الخزف ل macerate عينة الخلية، مع النيتروجين السائل وRNA كاشف العزل، حتى يتم تجانسه.بعد ذلك، نقل 500 ميكرولترات من العينة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقمة. ثم، إضافة 300 ميكرولترات من الكحول ايساميل الكلوروفورم، و 300 ميكرولترات من الفينول متساوي التوازن. اخلط العينة مع خلاط دوامة و جهاز طرد مركزي في 20، 000G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.بعد ذلك، نقل 300 ميكرولترات من المرحلة العليا إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الايزوبروبانول واحتضان الأنبوب لمدة ساعة واحدة في درجة مئوية سلبية 20. إضافة ملليلتر واحد من الإيثانول إلى بيليه.ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 12، 000G لمدة 10 دقائق وdeant المرحلة السائل. بعد ذلك، جفف العينة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إعادة تعليق استخراج الجيش الملكي النيبالي مع 25 ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC.أولاً، أضف اثنين ميكروغرام من إجمالي مستخلص الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير معقمة. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من 10X العازلة رد فعل وميكر واحد من DNase. جلب الحجم النهائي للتفاعل إلى 10 ميكرولترات مع المياه المعالجة DEPC.ثم، مزيج العينة والطرد المركزي في 2، 000G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، إضافة ميكرولتر واحد من 50 ميكرومولار الصوديوم ديامينيين رباعية، لوقف التفاعل.احتضان العينة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، تطبيق 100 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي إلى هلام agarose وتشغيل هلام. تصور سلامة الجيش الملكي النيبالي باستخدام نظام وثائق الصور هلام.أولاً، أضف 2.5 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغير. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من أوليغو ديوكسيثيميدين التمهيدي وملء الأنبوب إلى حجم النهائي من 13 ميكرولترات مع المياه الخالية من النوى. اخلط العينة والطرد المركزي في 2،000G لمدة دقيقة واحدة.احتضان العينة في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقتين. المقبل، إضافة أربعة ميكرولترات من 5X العازلة رد فعل، واثنين من ميكرولترات من مزيج dNTP وميكر واحد من النسخ العكسي للعينة.ثم، مزيج العينة بلطف والطرد المركزي في 2، 000G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، احتضان العينة في 45 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، ثم عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إضافة 7.5 ميكرولترات من 2X طق الحمض النووي البوليمرات و 0.1 ميكرومول من راتيكس، إلى أنبوب الطرد المركزي الجزئي PCR.ثم، إضافة 0.75 ميكرولتررز كل من التمهيدي إلى الأمام وعكس لتضخيم الجين CCS1. بعد ذلك، إضافة 600 نانوجرام من قالب CDNA. شكل رد فعل التضخيم في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.ثم، تحليل البيانات مع برنامج PCR. تزن غرام واحد من المواد الخلوية وحزمة في رقائق الألومنيوم. بعد macerating العينة، ونقلها إلى قارورة الزجاج وإضافة 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت الاستخراج.بعد ذلك، الطرد المركزي العينة في 20، 000G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. نقل 500 ميكروليترس aliquots في قوارير المبردة. مع مقياس الطيفي، وقياس تركيز البروتين من العينة في 562 نانومتر باستخدام مقايسة حمض bicinchoninic، مع الألبومين البقري كمعيار.أولاً، إعداد خليط التفاعل في أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة، وفقاً لبروتوكول النص. ثم، زيادة حجم إجمالي إلى 200 ميكرولترات مع 100 ميليمولار تريس HCL. تذكر، لا بد من سلامة الخاصة بك اتباع الاحتياطات المناسبة أثناء إعداد خليط التفاعل مع المواد المشعة.الحفاظ على أنبوب جهاز الطرد المركزي على الجليد الصغيرة وإضافة حجم من الكسر القابل للذوبان, تحتوي على 7-9 ملليغرام من البروتين. ثم، دوامة الخليط واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد هذا، الطرد المركزي العينات في 11،000G لمدة خمس دقائق.ثم، استرداد بعناية حجم 900 ميكرولتر، ونقل العينات إلى قارورة التلألؤ. بعد ذلك، يتبخر الكلوروفورم ليكتمل الجفاف في غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة. أضف خمسة ملليلترات من سائل التألق إلى القارورة.وأخيرا، تحليل النشاط الإشعاعي دمجها في الكافيين باستخدام عداد التلألؤ. في هذا البروتوكول، تم تحليل نمط امتصاص الكافيين عن طريق قياس كثافة TLC، من خلال طيف الضوء المرئي، والقراءة في أقصى امتصاص عند 273 نانومتر. منحنى الفصل من الكافيين على لوحة TLC، وأظهرت الترددات اللاسلكية بين 0.34، و 0.39.ويظهر الحمض النووي الريبي المستمد من الخلايا المعلقة عمليات فصل واضحة لأفرقة فرعية من 28 و18 و5 وحدات من RRNA، مما يشير إلى أن العينات كانت ذات جودة عالية. وأخيراً، تم الحصول على منحنى ذوبان من تحليل QPCR، الذي يظهر منتج تضخيم واحد لجين الكافيين synthase. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات التكنولوجيا الحيوية والكيمياء الحيوية لاستكشاف ثانوي استقلاب الأنسجة من زراعة القهوة والشاي و coco.لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي وعلم الأمراض الجزيئية يمكن أن تكون خطرة للغاية، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام القفازات والنظارات الواقية والمعدات الخاصة للمواد المشعة دائما عند إجراء هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

تعديل ناقلات التعبير باكولوفيروس لإنتاج يفرز البروتينات النباتية في خلايا الحشرات

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

نهج للتخصيص للإنتاج الانزيمي وتنقيه المنتجات الطبيعية ديتيربينيد

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

استخراج واستخلاص كمي للذوبان, المشع الإينوزيتول بولي فوسفات من أنواع النباتات المختلفة باستخدام SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...