Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Arbejdet i vores laboratorium blev finansieret af et tilskud fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) til SMTHS. Denne forskning blev også støttet af et fellowship tildeles RJPK (No. 37938) af CONACyT og Sistema Nacional de Investigadores (4422). Forfatterne takke CIATEJ for brug af sine anlæg under skrivning af dette manuskript. Særlig tak forlænges til Dr. Víctor Manuel González Mendoza med alle henstillinger i Molekylærbiologi sektion og Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM for faciliteterne under optagelserne af denne artikel.

1. koffein udvinding i celle suspensioner af C. arabica L.
<ol><li>Bruge C. arabica celle suspensioner9. Vedligeholde suspensioner af hver anden uge subkulturer i Murashige og Skoog medium på pH 4.3 med konstant 100 rpm ryster ved 25 ° C under kontinuerlig lys (8.3 W/m2).</li>
	<li>Høste celler under vakuum filtrering ved hjælp af 11 µm pore filtrerpapir og en Buchner tragt.</li>
	<li>Registrere den friske vægt indsamlet celler ved hjælp af en skala, pak dem i...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Vi præsenterer her de optimale betingelser for at vurdere koffeinindholdet, CS aktivitet og udskrift niveauer i en in vitro- plante vævskultur, såsom celle suspensioner af C. arabica. Tidligere rapporter har bekræftet at opretholde celler under lys bestråling og theobromin i substratet er passende parametre til at øge niveauet for koffein, gør det muligt at evaluere metoderne koffein adskillelse Brug af omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC). I øjeblikket, er der få rapporter, de...

Koffein er en sekundær metabolit, der er biosynthesized af planter af slægten Coffea1. Denne alkaloid tilhører familien Methylxanthin og betragtes som en kemisk fabrik forsvar, fordi det kan handle mod de skadelige virkninger af patogener og planteædere2,3. Derudover er denne metabolit ansvarlig for de stimulerende egenskaber af kaffe-drikke, som er almindeligt indtaget verden over4,5. På grund af dets egenskaber, er flere forskningsgrupper interesseret i at studere de biosyntetiske pathway og katabolisme af koffein6,7. I øjeblikket, tjene plante i vitro celle/vævskulturer som et alternativ til evaluering af koffein akkumulering under forskellige biotiske og abiotiske strategier8,9.
Koffein biosyntesen indebærer hydrolytisk udgivelsen af 7-Methylxanthin fra den tilsvarende ribose nucleoside efterfulgt af bestilte N-methylations på holdninger, 3 og 1. En specifik S- adenosylmetionin methionin (SAM)-afhængige N-methyltransferase (NMT) katalyserer methylering på position 7, hvorimod theobromin syntase (TS) og CS er involveret i 3 - og 1-methylations, henholdsvis producerer theobromin og koffein. Studiet af gener kodning særskilte NMTs har gjort det muligt at forstå den mekanisme, der regulerer koffein produktion10,11. CS, der har N -methyltransferase aktivitet, katalyserer de sidste to trin i de biosyntetiske pathway af koffein11. I kaffe træ kimplanter, har det vist sig at lys-stråling kan øge CS aktivitet, hvilket resulterer i en forhøjelse af koffein biosyntesen. For nylig, viste vi, at opretholdelsen af celle suspensioner af C. arabica L. under lys bestråling er den optimale betingelse for vurdering af de virkninger, der producerer abiotisk stressfaktorer påvirker de biosyntetiske pathway af koffein8. Oplysningerne i disse undersøgelser kan have programmer i metaboliske engineering og systemer biologi til at maksimere studiet af koffein biosyntetiske pathway i sådanne in vitro- systemer.
Da fordelene ved at opnå en passende model for studiet af koffein biosyntesen, optimeret vi udvinding betingelserne for koffein på celle suspensioner af C. arabica L. Det var også muligt at udvikle en nyttig protokol for at studere den enzymatiske aktivitet samt metodiske fremgangsmåde for at vurdere niveauet af genet udskrifter af Coffea koffein syntase 1 (CCS1) kodning dette enzym. Heri, rapporterer vi en protokol til at udtrække og kvantificere koffein i C. arabica celle suspensioner ved tyndtlagskromatografi og densitometri (TLC-densitometri).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) er en purin alkaloid i populære drikkevarer som kaffe og te. Denne sekundære metabolit betragtes som en kemisk forsvar, fordi det har antimikrobiel aktivitet og betragtes som en naturlig insektgift. Koffein kan også producere negative allelopathic effekter, der forhindrer vækst af omgivende planter. Derudover indtager mennesker verden koffein for sin smertestillende og stimulerende effekter. På grund af interesse i de teknologiske anvendelser af koffein, er forskning i de biosyntetiske pathway af dette stof vokset. Disse undersøgelser har primært fokuseret på at forstå de biokemiske og molekylære mekanismer, der regulerer biosyntesen af koffein. In vitro vævskultur er blevet et nyttigt system til at studere denne biosyntetiske pathway. Denne artikel vil beskrive en trinvis protokol for kvantificering af koffein og til måling af udskrift niveauer af genet (CCS1) kodning koffein syntase (CS) i celle suspensioner af C. arabica L. samt dets aktivitet.

Koffein ekstrakter fremstillet via processen præsenteres her blev analyseret af TLC-densitometri ved at underkaste prøver at plade kromatografi ifølge den ordning, der er vist i figur 1. At kvantificere niveauerne af koffein i celle ekstrakter, en kurve med forskellige koncentrationer af kommercielle standard for dette stof blev brugt (figur 2A). Mønster af absorbansen for koffein blev analyseret i det synlige lysspektrum (UV...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Denne protokol beskriver en effektiv metode til udvinding og kvantificering af koffein i celle suspensioner af C. arabica L. og en eksperimenterende proces for at vurdere den enzymatiske aktivitet af koffein syntase med udtryk niveau af det gen, der koder dette enzym.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for analytisk kemi, biokemi og bioteknologi. Såsom, hvad er de ændringer, der opstår i koffein biosyntese. Den største fordel ved denne teknik, er, at det kan anvendes til invitro plantemodeller, der producerer koffein.Til at begynde, tilsæt 10 milliliter acetone til de frysetørrede celler, og forsegle kolben, før du blander med vortex mixer i 30 sekunder. Bland derefter prøven ved 100 omdrejninger i minuttet med en rotator i fem timer ved stuetemperatur. Derefter skal prøven suspenderes igen med 25 mikroliter acetone.Først skal du anvende en mikroliter af den tidligere forberedte koffein ekstrakt til silica gel plader. Derefter udvikle TLC i kromatografi kammer med 10 milliliter af den mobile fase, cyclohexane acetone. Visualiser koffeinbåndene i kort bølgelængde ultraviolet, med en kompakt UV-lampe.Efter dette, kvantificere koffein niveauer ved densitometri på 273 nanometer. Brug filterpapir til at vakuumfiltrere den tidligere forberedte celleaffjedring. Brug derefter en porcelænsmørtel til at macerate celleprøven med flydende nitrogen og RNA isolationsreageser, indtil den er homogeniseret.Dernæst overføres 500 mikroliter af prøven til et sterilt mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes 300 mikroliter chloroform isoamylalkohol og 300 mikroliter af ligevægtet fenol. Bland prøven med en vortex mixer og centrifuge det ved 20, 000G i 15 minutter ved fire grader Celsius.Derefter overføres 300 mikroliter i den øvre fase til et rent mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes 200 mikroliter isopropanol og inkubere røret i en time ved negative 20 grader Celsius. Tilsæt en milliliter ethanol til pellet.Derefter centrifuge røret ved 12, 000G i 10 minutter og dekantere væskefasen. Dernæst tørres prøven i 1,5 timer ved stuetemperatur. Derefter skal RNA-ekstraktet igen suspenderes med 25 mikroliter DEPC-behandlet vand.Først tilsættes to mikrogram total RNA-ekstrakt til et sterilt mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes en mikroliter på 10X reaktionsbuffer og en mikroliter DNase. Reaktionens endelige volumen bringes til 10 mikroliter med DEPC-behandlet vand.Derefter blandes prøven og centrifuge ved 2, 000G i et minut. Derefter inkuberes prøven ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Derefter tilsættes en mikroliter på 50 mikromolar disodiumethylendiamindiamin tetraacetat for at stoppe reaktionen.Inkuber prøven ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Derefter anvende 100 nanogram RNA til en agarose gel og køre gelen. Visualiser RNA'ets integritet ved hjælp af et dokumentationssystem for gelfoto.Først tilsættes 2,5 mikrogram total RNA til et mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes en mikroliter oligo deoxythymidin primer og fyld røret til et endeligt volumen på 13 mikroliter med nukleasefrit vand. Prøven blandes og centrifugeres ved 2.000 G i et minut.Inkuber prøven ved 65 grader Celsius i fem minutter. Og så ved fire grader Celsius i to minutter. Dernæst tilsættes fire mikroliter af 5X reaktionsbuffer, to mikroliter dNTP-blanding og en mikroliter omvendt transskription til prøven.Derefter blandes prøven forsigtigt og centrifuge ved 2, 000G i et minut. Efter dette, inkubere prøven ved 45 grader Celsius i 50 minutter, og derefter ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Der tilsættes 7,5 mikroliter 2X Taq DNA-polymerase og 0,1 mikromoler af RAX til et PCR mikrocentrifugerør.Derefter tilsættes 0,75 mikroliter hver af fremad og omvendt primer for at forstærke CCS1-genet. Derefter skal du tilføje 600 nanogram CDNA-skabelon. Præforme forstærkningsreaktionen i realtid PCR som beskrevet i tekstprotokollen.Derefter analysere data med PCR-software. Afveje et gram cellulært materiale og pak det i aluminiumsfolie. Efter udblæning af prøven overføres den til et glashætteglas og tilsættes 2,5 milliliter ekstraktionsbuffer.Dernæst centrifuge prøven ved 20, 000G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør 500 mikroliter aliquots i kryogene hætteglas. Ved spektrofotometer måles proteinkoncentrationen af prøven ved 562 nanometer ved hjælp af en bicinchonin syreanalyse med kvæg serisk albumin som standard.Først forberede reaktionsblandingen i et mikrocentrifugerør i henhold til tekstprotokollen. Derefter øge den samlede volumen til 200 mikroliter med 100 millimolar tris HCL. Husk, at det er bydende nødvendigt for din egen sikkerhed at følge passende forholdsregler under forberedelse af reaktion blanding med radioaktivt materiale.Hold mikrocentrifugerøret på is og tilsæt et volumen af den opløselige fraktion, der indeholder syv til ni milligram protein. Derefter vortex blandingen og inkubere ved 30 grader Celsius i 30 minutter. Derefter centrifugeres prøverne ved 11.000 G i fem minutter.Derefter skal du omhyggeligt genvinde et volumen på 900 mikroliter, og overfør prøverne til et scintillationshætteglas. Dernæst fordampe kloroform til fuldstændig tørhed i hætten ved stuetemperatur. Tilsæt fem milliliter scintillationsvæske til hætteglasset.Endelig analysere radioaktivitet indarbejdet i koffein ved hjælp af en scintillation tæller. I denne protokol blev absorbansmønstret for koffein analyseret via TLC densitometri, gennem det synlige lysspektrum og læsning i maksimal absorption ved 273 nanometer. Adskillelsen kurve af koffein på TLC plade, viste en RF mellem 0,34, og 0,39.RNA stammer fra suspenderede celler udviser klare adskillelser af 28s, 18s og 5s RRNA underenheder, hvilket indikerer, at prøverne var af høj kvalitet. Endelig blev der fremstillet en smeltekurve fra QPCR-analysen, der viste et enkelt forstærkningsprodukt for koffeinsyntasegenet. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for bioteknologi og biokemi at udforske sekundære metaboliserende væv kultur fra kaffe, te og coco.Glem ikke, at arbejde med radioaktivitet og molekylær patologi kan være yderst farligt, og forholdsregler såsom brug af handsker, beskyttelsesbriller og særligt udstyr til radioaktivt materiale skal altid træffes, når denne procedure udføres.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Ændre Baculovirus udtryk vektorer til at producere udskilles vegetabilske proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

En kolorimetrisk analyse af citrat syntase aktivitet i Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En tilpasselig tilgang til enzymatisk produktion og rensning af Diterpenoid naturprodukter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Opnåelse af udskriftsdata af høj kvalitet fra kornfrø ved en modificeret metode til genekspressionsprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Ekstraktion og kvantificering af opløselige, radioaktivt mærkede inositolpolyfosfater fra forskellige plantearter ved hjælp af SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Expression, Fast Protein Rensning Protokoller og krystallisering af wild type og mutant former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...