Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Het werk van onze laboratorium werd gefinancierd door een subsidie van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS. Dit onderzoek werd ook ondersteund door een beurs toegekend aan RJPK (nr. 37938) door de CONACyT en de Sistema Nacional de Investigadores (4422). De auteurs bedanken CIATEJ voor het gebruik van zijn installaties tijdens het schrijven van dit manuscript. Speciale dank worden uitgebreid tot Dr. Víctor Manuel González Mendoza voor alle aanbevelingen in de sectie van de moleculaire biologie en Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM voor de faciliteiten tijdens het filmen van dit artikel.

1. Cafeïne-extractie in cel suspensies van C. arabica L.
<ol><li>C. arabica cel schorsingen9gebruiken. Het handhaven van de schorsingen door tweewekelijkse subculturen in Murashige en Skoog medium bij een pH 4.3 met constante 100 t/min schudden bij 25 ° C onder continu licht (8.3 W/m2).</li>
	<li>Het oogsten van de cellen onder vacuüm filtratie met 11 µm porie filtreerpapier en een Buchner trechter.</li>
	<li>Registreer het verse gewicht van de verzamelde cellen ...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Wij presenteren hier de optimale omstandigheden voor de evaluatie van de cafeïne inhoud, CS activiteit en afschrift niveaus in een in vitro plantaardige weefselkweek, zoals cel schorsingen van C. arabica. Eerdere verslagen hebben bevestigd dat handhaving cellen onder lichte bestraling en in aanwezigheid van theobromine in het kweekmedium geschikt parameters zijn voor het verhogen van het niveau van cafeïne, waardoor het mogelijk is om te evalueren van de cafeïne scheidingsmethoden met behulp van reve...

Cafeïne is een secundaire metaboliet thats levende door planten van het geslacht Coffea1. Dit alkaloïde behoort tot de familie van de methylxanthine en wordt beschouwd als een chemische fabriek verdediging, omdat het tegen de negatieve effecten van ziekteverwekkers en planteneters2,3 optreden kan. Deze metaboliet is daarnaast verantwoordelijk voor de stimulerende eigenschappen van de koffie drinken, die vaak verbruikt wereldwijd4,5. Als gevolg van zijn eigenschappen, zijn verschillende onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het bestuderen van de biosynthetic traject en het katabolisme van cafeïne6,7. Momenteel, dienen plant in vitro cel/weefselcultures als alternatief voor de evaluatie van cafeïne accumulatie onder verschillende biotische en abiotische strategieën8,9.
Cafeïne biosynthese impliceert de Hydrolytische release van 7-methylxanthine van de overeenkomstige ribose nucleoside gevolgd door bestelde N-methyleringen op positie 3 en 1. Een specifieke S- adenosyl methionine (SAM)-afhankelijke N-methyltransferase (NMT) katalyseert de Methyleren aan positie 7, overwegende dat theobromine synthase (TS) en CS zijn betrokken in de 3 - en 1-methyleringen, respectievelijk produceren theobromine en cafeïne. De studie van genen coderend voor verschillende meetposten heeft toegestaan het mechanisme dat cafeïne productie10,11 regeltte begrijpen. CS, heeft N -methyltransferase activiteit, katalyseert de laatste twee stappen van het biosynthetic leertraject van cafeïne11. In koffie boom zaailingen, is gebleken dat licht straling CS activiteit, wat in een toename van de biosynthese van cafeïne resulteert kan verhogen. Onlangs, toonden we dat het onderhoud van cel schorsingen van C. arabica L. onder lichte bestraling de optimale voorwaarde is voor de evaluatie van de effecten die produceren abiotische stressfactoren beïnvloeden de biosynthetic traject van cafeïne8. De informatie die is verkregen in deze studies wellicht toepassingen in de metabole engineering en systemen biologie voor het maximaliseren van de studie van de cafeïne biosynthetic pathway in dergelijke systemen in vitro .
Gezien de voordelen van het verkrijgen van een geschikt model voor de studie van cafeïne biosynthese, wij de voorwaarden van de winning voor cafeïne op cel schorsingen van C. arabica L. geoptimaliseerd Het was ook mogelijk om een nuttige protocol voor de studie van de enzymatische activiteit, evenals de methodologische stappen voor de beoordeling van het niveau van gene afschriften van Coffea cafeïne synthase 1 (CCS1) codering van dit enzym ontwikkelen. Hierin, rapporteren we een protocol voor het uitpakken en kwantificeren van cafeïne in C. arabica cel suspensies door dunne-laag chromatografie en densitometrie (TLC-densitometrie).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Cafeïne (1,3,7-trimethylxanthine) is een purine alkaloïde in populaire dranken zoals koffie en thee aanwezig. Deze secundaire metaboliet wordt beschouwd als een chemische verdediging, omdat het heeft antibacteriële activiteit en wordt beschouwd als een natuurlijke insecticide. Cafeïne kan ook negatieve allelopatische effecten die voorkomen de groei van de omringende planten dat produceren. Bovendien, verbruiken mensen over de hele wereld cafeïne voor de pijnstillende en stimulerend gevolgen. Als gevolg van de interesse in de technologische toepassingen van cafeïne, onderzoek naar de biosynthetic traject van dit samengestelde gegroeid. Deze studies zijn primair gericht op het begrijpen van de biochemische en moleculaire mechanismen die de biosynthese van cafeïne regelen. In vitro weefselkweek is uitgegroeid tot een nuttig systeem voor de studie van dit biosynthetic traject. Dit artikel beschrijft een stapsgewijze protocol voor de kwantificering van cafeïne en voor het meten van de niveaus van de transcriptie van het gen (CCS1) codering cafeïne synthase (CS) in cel suspensies van C. arabica L., alsmede haar activiteit.

Cafeïne extracten verkregen via het proces hier gepresenteerd werden geanalyseerd door TLC-densitometrie door het onderwerpen van de monsters te plaat chromatografie volgens de regeling die is afgebeeld in Figuur 1. Kwantificeren van de niveaus van cafeïne in de cel extracten, een curve met verschillende concentraties van commerciële standaard voor deze verbinding werd gebruikt (figuur 2A). Het patroon van absorptie voor cafe?...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de extractie en kwantificering van cafeïne in cel suspensies van C. arabica L. en een experimentele proces voor de evaluatie van de enzymatische activiteit van cafeïne synthase met het niveau van de expressie van het gen dat dit enzym codeert.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de analytische chemie, biochemie en biotechnologie. Zoals, wat zijn de veranderingen die optreden in de cafeïne biosynthese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek, is dat het kan worden toegepast op invitro plant modellen die cafeïne produceert.Om te beginnen voegt u 10 milliliter aceton toe aan de lyophilized cellen en sluit u de kolf af voordat u de vortexmixer gedurende 30 seconden mengt. Meng vervolgens het monster bij 100 rpm met een rotator gedurende vijf uur bij kamertemperatuur. Daarna moet u het monster opnieuw opschorten met 25 microliter aceton.Breng eerst een microliter van het eerder bereide cafeïne-extract aan op de silicagelplaten. Ontwikkel vervolgens de TLC in de chromatografiekamer met 10 milliliter van de mobiele fase, cyclohexaanaceton. Visualiseer de cafeïnebanden in korte golflengte ultraviolet, met een compacte UV-lamp.Daarna kwantificeren cafeïne niveaus door densitometrie op 273 nanometer. Met behulp van filterpapier filtert u de eerder voorbereide celsuspensie. Gebruik vervolgens een porseleinmortel om het celmonster te macereren, met vloeibare stikstof en RNA-isolatiereagens, totdat het gehomogeniseerd is.Breng vervolgens 500 microliter van het monster over naar een steriele microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 300 microliter chloroforme isoamylalcohol toe en 300 microliter van geëquilibreerd fenol. Meng het monster met een vortex mixer en centrifugeren op 20,000G gedurende 15 minuten op vier graden Celsius.Breng hierna 300 microliter van de bovenste fase over naar een schone microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 200 microliter isopropanol toe en broed de buis gedurende een uur uit bij negatieve 20 graden Celsius. Voeg een milliliter ethanol toe aan de pellet.Dan, centrifuge de buis op 12,000 G gedurende 10 minuten en decanteren de vloeibare fase. Droog vervolgens het monster 1,5 uur op kamertemperatuur. Hang vervolgens het RNA-extract opnieuw op met 25 microliter met DEPC-behandeld water.Voeg eerst twee microgram totaal RNA-extract toe aan een steriele microcentrifugebuis. Voeg vervolgens een microliter van 10X-reactiebuffer en één microliter DNase toe. Breng het uiteindelijke volume van de reactie naar 10 microliter met DEPC-behandeld water.Meng vervolgens het monster en centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut. Vervolgens, incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg hierna een microliter van 50 micromolar disodium ethyleendiamine tetraacetaat toe om de reactie te stoppen.Broed het monster 10 minuten in op 65 graden Celsius. Breng vervolgens 100 nanogram RNA aan op een agarosegel en voer de gel uit. Visualiseer de integriteit van het RNA met behulp van een gel foto documentatiesysteem.Voeg eerst 2,5 microgram totaal RNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg vervolgens een microliter oligo deoxythymidine primer toe en vul de buis tot een eindvolume van 13 microliters met nuclease-vrij water. Meng het monster en centrifugeren op 2,000 G voor een minuut.Broed het monster vijf minuten lang uit op 65 graden Celsius. En dan op vier graden Celsius gedurende twee minuten. Voeg vervolgens vier microliters 5x-reactiebuffer, twee microliters van dNTP-mix en één microliter omgekeerde transcriptase toe aan het monster.Meng vervolgens het monster voorzichtig en centrifuge op 2,000 G gedurende een minuut. Daarna, incubeer het monster op 45 graden Celsius gedurende 50 minuten, en vervolgens op 70 graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg 7,5 microliter 2x Taq DNA polymerase en 0,1 micromol RAX toe aan een PCR micro centrifugebuis.Voeg vervolgens 0,75 microliters toe elk van voorwaartse en omgekeerde primer om het CCS1-gen te versterken. Voeg hierna 600 nanogram CDNA-sjabloon toe. Voorvormen van de versterking reactie in real-time PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.Analyseer vervolgens de gegevens met de PCR-software. Weeg een gram cellulair materiaal af en verpak het in aluminiumfolie. Na het macereren van het monster, breng het naar een glazen flacon en voeg 2,5 milliliter extractie buffer.Vervolgens centrifuge het monster op 20,000G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng 500 microliters aliquots over in cryogene flesjes. Meet met een spectrofotometer de eiwitconcentratie van het monster op 562 nanometer met behulp van een bicinchoninic zuurtest, met runder seric albumine als standaard.Bereid eerst het reactiemengsel in een microcentrifugebuis, volgens het tekstprotocol. Verhoog vervolgens het totale volume tot 200 microliter met 100 millimolar tris HCL. Vergeet niet, is het noodzakelijk voor uw eigen veiligheid om de juiste voorzorgsmaatregelen te volgen tijdens de voorbereiding van reactie mengsel met radioactief materiaal.Houd de microcentrifuge buis op ijs en voeg een volume van de oplosbare fractie, met zeven tot negen milligram eiwit. Dan, vortex het mengsel en incubeer op 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Hierna worden de monsters vijf minuten lang op 11.000 G gecentrifuger.Herstel vervolgens voorzichtig een volume van 900 microliters en breng de monsters over naar een scintillatieblad. Verdampen vervolgens de chloroform om de droogte in de kap bij kamertemperatuur te voltooien. Voeg vijf milliliter scintillatievloeistof toe aan de flacon.Ten slotte, analyseren van de radioactiviteit opgenomen in de cafeïne met behulp van een scintillatie teller. In dit protocol werd het patroon van absorptie voor cafeïne geanalyseerd via TLC densitometrie, door het zichtbare lichtspectrum, en het meten in maximale absorptie op 273 nanometer. De scheidingscurve van cafeïne op de TLC-plaat, toonde een RF tussen 0,34 en 0,39.Het RNA afgeleid van zwevende cellen vertoont duidelijke scheidingen van de 28s, 18s en 5s RRNA subeenheden, wat aangeeft dat de monsters van hoge kwaliteit waren. Ten slotte werd een smeltcurve verkregen uit de QPCR-analyse, met een enkel versterkingsproduct voor het cafeïnesynthease-gen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biotechnologie en biochemie om de secundaire metaboliserende weefselkweek van koffie, thee en coco te verkennen.Vergeet niet dat het werken met radioactiviteit en moleculaire pathologie uiterst gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van handschoenen, veiligheidsbrillen en speciale apparatuur voor radioactief materiaal moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Wijzigen Baculovirus expressievectoren voor de productie van plantaardige eiwitten in Insect cellen uitgescheiden

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Een aanpasbare aanpak voor de enzymatische productie en zuivering van Diterpenoid natuurlijke producten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Het verkrijgen van hoogwaardige transcriptoomgegevens van graanzaden door middel van een gewijzigde methode voor genexpressieprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Extractie en kwantificering van oplosbare, radiogelabelde Inositol Polyfosfaten van verschillende plantensoorten met SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...