Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
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Les travaux de notre laboratoire a été financée par une subvention par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) à SMTHS. Aussi, cette recherche a été financée par une bourse de recherche accordée à RJPK (no 37938) par CONACyT et le Sistema Nacional de Investigadores (4422). Les auteurs remercient CIATEJ pour l’utilisation de ses installations pendant l’écriture de ce manuscrit. Spécial remerciements à m. Víctor Manuel González Mendoza pour toutes les recommandations dans la section de biologie moléculaire et Rodríguez Mendoza Valentín, IFC, UNAM pour les installations pendant le tournage de cet article.

1. caféine Extraction dans des Suspensions cellulaires c. arabica L.
<ol><li>Utiliser c. arabica cellule suspensions9. Maintenir les suspensions de sous-cultures toutes les deux semaines dans le milieu de Murashige et Skoog à pH 4,3 avec constant 100 tr/min secouant à 25 ° C sous une lumière continue (8,3 W/m2).</li>
	<li>Récolter les cellules sous la filtration sous vide à l’aide de papier-filtre pore de 11 µm et d’un entonnoir de Buchner.</li>
	<li>Enre...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Nous présentons ici les conditions optimales permettant d’évaluer la contenu de caféine, niveaux d’activité et de transcription CS dans in vitro plant tissue culture, tels que des suspensions de cellules de c. arabica. Précédents rapports ont confirmé que les cellules maintien sous irradiation lumineuse et en présence de théobromine dans le milieu de culture sont les paramètres appropriés pour augmenter le niveau de caféine, ce qui permet d’évaluer les méthodes de séparation de caf?...

La caféine est un métabolite secondaire qui est biosynthétisée à partir de plantes du genre Coffea1. Cet alcaloïde appartient à la famille des méthylxanthines et est considéré comme une défense de l’usine de produits chimiques car il peut agir contre les effets néfastes des pathogènes et des herbivores,2,3. En outre, ce métabolite est responsable des propriétés stimulantes de la boisson de café, qui est couramment consommée dans le monde entier4,,5. En raison de ses propriétés, sont intéressés par plusieurs groupes de recherche étudie la voie de biosynthèse et de catabolisme de caféine6,7. Actuellement, des cultures de plantes in vitro cellules/tissus servent d’alternative pour évaluer l’accumulation de la caféine sous diverses stratégies biotiques et abiotiques8,9.
Biosynthèse de caféine implique la libération hydrolytique des 7-méthylxanthine de nucléoside ribose correspondante suivie d’ordonnée N-méthylations aux positions 3 et 1. Une spécifique S- adénosyl méthionine (SAM)-charge N-méthyltransférase (NMT) catalyse la méthylation en position 7, tandis que théobromine synthase (TS) et CS sont impliqués dans la 3 - et 1-méthylations, respectivement, produisant la théobromine et caféine. L’étude des gènes codant pour les territoires non métropolitains distincts a permis de comprendre le mécanisme qui régule la production de caféine10,11. CS, qui possède l’activité N -méthyltransférase, catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse de la caféine,11. Chez les plantules de caféier, il a été démontré que le rayonnement lumineux peut augmenter l’activité CS, qui se traduit par une augmentation dans la biosynthèse de la caféine. Récemment, nous avons montré que l’entretien des suspensions cellulaires de c. arabica L. sous irradiation lumineuse est la condition optimale pour évaluer les effets que produisent des facteurs de stress abiotique ayant une incidence sur la voie de biosynthèse de caféine8. Les renseignements obtenus dans ces études pourraient avoir des applications en biologie de systèmes et génie métabolique pour maximiser l’étude de la biosynthèse de la caféine dans de tels systèmes in vitro .
Étant donné les avantages d’obtenir un modèle approprié pour l’étude de la biosynthèse de la caféine, nous avons optimisé les conditions d’extraction de la caféine sur des suspensions cellulaires c. arabica L. Il était également possible d’élaborer un protocole utile pour l’étude de l’activité enzymatique, mais aussi les étapes méthodologiques permettant d’évaluer le niveau de transcription des gènes de Coffea caféine synthase 1 (CCS1) codant pour cette enzyme. Ici, nous présentons un protocole pour extraire et quantifier la caféine dans les suspensions de cellules de c. arabica par chromatographie sur couche mince et densitométrie (TLC-densitométrie).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Caféine (1,3,7-trimethylxanthine) est un alcaloïde de la purine présent dans les boissons populaires tels que le café et le thé. Ce métabolite secondaire est considéré comme un moyen de défense chimique, car il a une activité antimicrobienne et est considéré comme un insecticide naturel. Caféine peut également produire des effets allélopathiques négatifs qui empêchent la croissance des plantes environnantes. En outre, les gens partout dans le monde consomment caféine pour ses effets analgésiques et stimulants. En raison de l’intérêt pour les applications technologiques de la caféine, recherches sur la voie de biosynthèse de ce composé a augmenté. Ces études ont principalement porté sur la compréhension des mécanismes biochimiques et moléculaires qui régulent la biosynthèse de la caféine. Culture de tissus in vitro est devenu un système utile pour l’étude de cette voie de biosynthèse. Cet article décrit un protocole étape par étape pour la quantification de la caféine et de mesure des niveaux de transcription du gène (CCS1) codant synthase (CS) de la caféine dans des suspensions de cellules de c. arabica L. en plus de son activité.

Les extraits de caféine obtenus via le processus présenté ici ont été analysés par TLC-densitométrie en soumettant les échantillons pour la plaque de chromatographie selon le schéma illustré à la Figure 1. Pour quantifier les niveaux de caféine dans les extraits de cellules, une courbe avec différentes concentrations de norme commerciale pour ce composé a été utilisé (Figure 2 a). Le modèle de l’absorbance pou...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extraction de la caféine, l’activité enzymatique et l’Expression génique de caféine Synthase de Suspensions de cellules végétales

Ce protocole décrit une méthodologie efficace pour l’extraction et le dosage de la caféine dans des suspensions cellulaires de c. arabica L. et un processus d’expérimentation pour l’évaluation de l’activité enzymatique de synthase de caféine avec le niveau d’expression de le gène codant pour cette enzyme.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la chimie analytique, de la biochimie et de la biotechnologie. Par exemple, quels sont les changements qui se produisent dans la biosynthèse de la caféine. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle peut être appliquée aux modèles de plantes invitro qui produisent de la caféine.Pour commencer, ajouter 10 millilitres d’acétone aux cellules lyophilisées et sceller le flacon avant de mélanger avec le mélangeur vortex pendant 30 secondes. Ensuite, mélanger l’échantillon à 100 rpm avec un rotateur pendant cinq heures à température ambiante. Après cela, suspendre à nouveau l’échantillon avec 25 microlitres d’acétone.Tout d’abord, appliquez un microlitre de l’extrait de caféine précédemment préparé sur les plaques de gel de silice. Ensuite, développez le TLC dans la chambre de chromatographie avec 10 millilitres de la phase mobile, l’acétone cyclohexane. Visualisez les bandes de caféine en ultraviolet à longueur d’onde courte, à l’aide d’une lampe UV compacte.Après cela, quantifier les niveaux de caféine par densitométrie à 273 nanomètres. À l’aide de papier filtre, filtrer sous vide la suspension cellulaire préparée précédemment. Ensuite, utilisez un mortier en porcelaine pour macérer l’échantillon cellulaire, avec de l’azote liquide et un réagenage d’isolement de l’ARN, jusqu’à ce qu’il soit homogénéisé.Ensuite, transférez 500 microlitres de l’échantillon dans un tube stérile de micro centrifugeuse. Ajoutez ensuite 300 microlitres d’alcool d’isoamyle chloroforme et 300 microlitres de phénol équilibré. Mélanger l’échantillon avec un mélangeur vortex et le centrifuger à 20 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Après cela, transférer 300 microlitres de la phase supérieure dans un tube de micro centrifugeuse propre. Ensuite, ajouter 200 microlitres d’isopropanol et incuber le tube pendant une heure à 20 degrés Celsius négatifs. Ajouter un millilitre d’éthanol à la pastille.Ensuite, centrifugez le tube à 12 000 G pendant 10 minutes et décantez la phase liquide. Ensuite, séchez l’échantillon pendant 1,5 heure à température ambiante. Ensuite, suspendez à nouveau l’extrait d’ARN avec 25 microlitres d’eau traitée par DEPC.Tout d’abord, ajouter deux microgrammes d’extrait total d’ARN à un tube stérile de micro centrifugeuse. Ensuite, ajoutez un microlitre de tampon de réaction 10X et un microlitre de DNase. Apportez le volume final de la réaction à 10 microlitres avec de l’eau traitée par DEPC.Ensuite, mélanger l’échantillon et la centrifugeuse à 2000G pendant une minute. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, ajouter un microlitre de 50 micromolaire disodium éthylène diamine tétraacetate, pour arrêter la réaction.Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, appliquez 100 nanogrammes d’ARN sur un gel d’agarose et exécutez le gel. Visualisez l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un système de documentation photo gel.Tout d’abord, ajouter 2,5 microgrammes d’ARN total à un tube de micro centrifugeuse. Ensuite, ajoutez un microlitre d’amorce oligo deoxythymidine et remplissez le tube à un volume final de 13 microlitres avec de l’eau sans nucléase. Mélanger l’échantillon et le centrifuger à 2000G pendant une minute.Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Et puis à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de tampon de réaction 5X, deux microlitres de mélange dNTP et un microlitre de transcriptase inverse à l’échantillon.Ensuite, mélanger l’échantillon doucement et la centrifugeuse à 2000G pendant une minute. Après cela, incuber l’échantillon à 45 degrés Celsius pendant 50 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 7,5 microlitres de polymésase d’ADN 2X Taq et 0,1 micromoles de RAX à un tube de micro centrifugeuse PCR.Ensuite, ajoutez 0,75 microlitres chacun d’amorce avant et arrière pour amplifier le gène CCS1. Après cela, ajouter 600 nanogrammes de modèle CDNA. Préformer la réaction d’amplification en temps réel PCR tel que décrit dans le protocole de texte.Ensuite, analyser les données avec le logiciel PCR. Pesez un gramme de matière cellulaire et emballez-le dans du papier d’aluminium. Après macération de l’échantillon, transférez-le sur un flacon de verre et ajoutez 2,5 millilitres de tampon d’extraction.Ensuite, centrifugez l’échantillon à 20 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer 500 microlitres aliquots dans des flacons cryogéniques. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la concentration protéique de l’échantillon à 562 nanomètres à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique, avec de l’albumine sérique bovine comme norme.Tout d’abord, préparer le mélange de réaction dans un tube de micro centrifugeuse, selon le protocole de texte. Ensuite, augmenter le volume total à 200 microlitres avec 100 millimolar tris HCL. Rappelez-vous, il est impératif pour votre propre sécurité de suivre les précautions appropriées pendant la préparation du mélange de réaction avec des matières radioactives.Gardez le tube de micro centrifugeuse sur la glace et ajoutez un volume de la fraction soluble, contenant de sept à neuf milligrammes de protéines. Ensuite, vortex le mélange et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après ça, centrifuger les échantillons à 11 000 G pendant cinq minutes.Ensuite, récupérez soigneusement un volume de 900 microlitres, et transférez les échantillons sur un flacon de scintillation. Ensuite, évaporez le chloroforme pour compléter la sécheresse dans le capot à température ambiante. Ajouter cinq millilitres de liquide de scintillation au flacon.Enfin, analyser la radioactivité incorporée dans la caféine à l’aide d’un compteur de scintillation. Dans ce protocole, le modèle d’absorption pour la caféine a été analysé par la densitométrie de TLC, par le spectre visible de lumière, et la lecture dans l’absorption maximale à 273 nanomètres. La courbe de séparation de la caféine sur la plaque de TLC, a montré un RF entre 0.34, et 0.39.L’ARN dérivé des cellules suspendues présente des séparations claires des sous-unités RRNA des années 28, 18 et 5, ce qui indique que les échantillons étaient de haute qualité. Enfin, une courbe de fonte a été obtenue à partir de l’analyse QPCR, montrant un produit d’amplification unique pour le gène synthase de caféine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biotechnologie et de la biochimie pour explorer la culture secondaire des tissus métabolisants à partir du café, du thé et du coco.N’oubliez pas que travailler avec la radioactivité et la pathologie moléculaire peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que l’utilisation de gants, lunettes et équipements spéciaux pour les matières radioactives doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recherche

Biochimie

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Une méthode simple d&#39;extraction fractionnée pour l&#39;analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d&#39;un seul échantillon

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

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Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modification des vecteurs d’Expression Baculovirus pour produire sécrétée des protéines végétales dans des cellules d’insecte

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

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Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Extraction et quantification de polyphosphates solubles et radioalétiques d’inositol provenant de différentes espèces végétales à l’aide de SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...