Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

העבודה של המעבדה שלנו מומן על ידי מענק Consejo נאסיונאל דה Ciencia, y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS. מחקר זה גם נתמך על ידי התחברות שהוענקו RJPK (מס 37938) מאת CONACyT, את "סיסטמה" נסיונאל דה Investigadores (4422). המחברים תודה CIATEJ על השימוש של התקנות שלה במהלך הכתיבה של כתב היד הזה. תודה מיוחדת מורחבות כדי ד ר Víctor מנואל גונזלס מנדוזה לקבלת המלצות כל סעיף ביולוגיה מולקולרית, ולנטין מנדוזה רודריגס, IFC, UNAM מתקנים במהלך הצילומים של מאמר זה.

1. קפאין החילוץ ב השעיות תא של ערביקה ג ל'
<ol><li>השתמש ערביקה ג תא המתלים9. לשמר את המתלים על-ידי התרבויות דו-שבועיים בינוני Murashige ו- Skoog ב- pH 4.3 עם 100 סל"ד קבוע רועד 25 ° c תחת תאורה רציפה (8.3 W/m2).</li>
	<li>לקצור את התאים תחת ואקום סינון באמצעות נייר סינון נקבובית מיקרומטר 11 ו?...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

אנו מציגים כאן את תנאים אופטימליים עבור הערכת את הקפאין תוכן, פעילות CS ורמות תעתיק במבחנה לשתול תרביות רקמה, כגון תא השעיות של ערביקה ג. בדו"חות קודמים אישרו כי שמירה על תאים תחת אור הקרנה ובפני תאוברומין במדיום תרבות הם פרמטרים מתאימים להגדיל את רמת של קפאין, כך שניתן להעריך את שי...

קפאין הוא מטבוליט משני זה biosynthesized על-ידי צמחים הסוג קפה1. אלקלואיד הזה שייך למשפחת methylxanthine, נחשב כהגנה מפעל כימי כי הוא יכול להתנהג מול ההשפעות השליליות של גורמי מחלה, אוכלי עשב2,3. בנוסף, מטבוליט זו אחראית על מאפייני מגרה לשתות קפה, אשר הוא נצרך בדרך כלל עולמית4,5. בשל תכונותיו, מספר קבוצות מחקר מעוניינות ללמוד את מסלול biosynthetic הוחלף נגזר ולבצע קטבוליזם של קפאין6,7. כיום, המפעל במבחנה תרבויות תא/רקמות לשמש אלטרנטיבה להערכת קפאין הצטברות תחת אסטרטגיות והאביוטיים ביוטיים שונים8,9.
קפאין ביוסינטזה מערבת את שחרור hydrolytic של 7-methylxanthine nucleoside ריבוז המתאים ואחריו מסודרות N-methylations-עמדות 3 ו- 1. ספציפית S- adenosyl מתיונין (SAM)-N התלויים-(nmt ב) methyltransferase מזרז מתילציה במיקום 7, ואילו תאוברומין סינתאז (TS) במדעי המחשב הם מעורבים ב 3 - ו 1-methylations, בהתאמה, בהפקת תאוברומין ו קפאין. המחקר של גנים קידוד NMTs ברורים אפשרה להבנת המנגנון המווסת קפאין ייצור10,11. הפקולטה למדעי המחשב, אשר יש N -פעילות methyltransferase, מזרז את שני השלבים האחרונים של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין11. בשתילי עץ הקפה, הוכח כי קרינה אור יכול להגביר פעילות בפקולטה למדעי המחשב, כשהתוצאה היא עלייה ביוסינטזה קפאין. לאחרונה, הראינו כי שמירה על התא השעיות של ערביקה ג ל' תחת אור הקרנה היא התנאי האופטימלית להערכת ההשפעות המייצרים והאביוטיים גורמים להשפיע על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין8. המידע הנקלט במחקרים אלה ייתכן יישומים בביולוגיה מערכות והנדסה מטבולית עבור למקסם את המחקר של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר קפאין במערכות כאלה במבחנה .
לאור היתרונות של קבלת מודל מתאים לצורך המחקר של קפאין ביוסינטזה, אנחנו ממוטב תנאי מיצוי קפאין על התא המתלים של ערביקה ג ל' היה זה גם אפשר לפתח פרוטוקול שימושי ללמוד את פעילות אנזימטי וכן את השלבים מתודולוגי להערכת רמת גן תעתיקים של קפה קפאין סינתאז 1 (CCS1) קידוד אנזים זה. במסמך זה, אנו מדווחים על פרוטוקול כדי לחלץ ולכמת קפאין ב השעיות תא ערביקה ג על ידי שכבת דק ו- densitometry (TLC-densitometry).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

קפאין (1,3,7-trimethylxanthine) הוא אלקלואיד פורין נוכח משקאות פופולריים כמו קפה ותה. מטבוליט המשני הזה נחשב הגנה כימית בגלל זה יש פעילות מיקרוביאלית, והוא נחשב של חרקים טבעי. קפאין יכול לייצר גם השפעות שליליות allelopathic למנוע את התפתחותם של צמחים שמסביב. בנוסף, אנשים ברחבי העולם צורכים קפאין על השפעותיו להרגעה, מופחתים. בשל עניין היישומים הטכנולוגיים של קפאין, מחקר על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של מתחם זה גדל. מחקרים אלה התמקדו בעיקר הבנת המנגנונים הביוכימי והמולקולרי המסדירים ביוסינטזה של קפאין. במבחנה תרביות רקמה הפכה מערכת שימושי ללמוד מסלול זה biosynthetic הוחלף נגזר. מאמר זה יתאר פרוטוקול צעד אחר צעד עבור כימות של קפאין, מדידת הרמות את התעתיק של הגן (CCS1) אשר קידוד קפאין סינתאז (CS) ב השעיות תא של ערביקה ג ל, כמו גם את פעילותה.

תמציות קפאין שהושג דרך התהליך המוצג כאן נותחו על ידי TLC-densitometry במינים את הדוגמאות כדי צלחת כרומטוגרפיה על פי התכנית המוצגת באיור1. כדי לכמת את הרמות של קפאין תמציות תא, עקומה עם ריכוזים שונים של תקן מסחרי מתחם זה היה בשימוש (איור 2 א). הדפוס ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה יעיל עבור חילוץ ו כימות של קפאין ב השעיות תא של ערביקה ג ל' ואת תהליך ניסיוני להערכת הפעילות האנזימטית מתרחשת של קפאין סינתאז עם רמת ביטוי הגן המקודד אנזים זה.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הכימיה האנליטית, הביוכימיה והביוטכנולוגיה. כגון, מהם השינויים המתרחשים בביוסינתזה של הקפאין. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שזה יכול להיות מיושם על מודלים צמחיים invitro המייצרת קפאין.כדי להתחיל, להוסיף 10 מיליליטר של אצטון לתאים lyophilized, ולאטום את הבקבוק לפני ערבוב עם מערבל מערבולת במשך 30 שניות. לאחר מכן, מערבבים את המדגם ב 100 סל"ד עם מסובב במשך חמש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את המדגם עם 25 microliters של אצטון.ראשית, להחיל מיקרוליטר אחד של תמצית קפאין מוכן בעבר על צלחות ג'ל סיליקה. לאחר מכן, לפתח את TLC בתא כרומטוגרפיה עם 10 מיליליטר של השלב הנייד, אצטון cyclohexane. דמיינו את רצועות הקפאין באולטרה סגול באורך גל קצר, עם מנורת UV קומפקטית.לאחר מכן, לכמת את רמות הקפאין על ידי densitometry ב 273 ננומטר. באמצעות נייר סינון, ואקום לסנן את השעיית התא שהוכן בעבר. לאחר מכן, להשתמש מרגמה חרסינה כדי macerate מדגם התא, עם חנקן נוזלי RNA בידוד reagent, עד שהוא הומוגני.לאחר מכן, להעביר 500 microliters של המדגם לצינור מיקרו צנטריפוגה מיקרו סטרילי. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של אלכוהול isoamyl כלורופורם, ו 300 microliters של פנול שיווי משקל. מערבבים את המדגם עם מערבל מערבולת וצנטריפוגה אותו ב 20, 000G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להעביר 300 microliters של השלב העליון לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של isopropanol ו דגירה הצינור במשך שעה אחת ב 20 מעלות צלזיוס שלילי. מוסיפים מיליליטר אחד של אתנול לכדור.לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור ב 12, 000G במשך 10 דקות ו decant השלב הנוזלי. לאחר מכן, ייבשו את הדגימה למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להשעות מחדש את תמצית RNA עם 25 microliters של מים שטופלו DEPC.ראשית, להוסיף שני מיקרוגרם של תמצית RNA הכולל לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של מאגר תגובה 10X ומיקרוליטר אחד של DNase. הביאו את הנפח הסופי של התגובה ל-10 מיקרוליטרים עם מים שטופלו ב-DEPC.לאחר מכן, מערבבים את הדגימה ואת הצנטריפוגה ב 2, 000G לדקה אחת. לאחר מכן, הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של 50 דיסודיום מיקרומולר דימין טטראקטט, כדי לעצור את התגובה.דגירה המדגם ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להחיל 100 ננוגרם של RNA על ג'ל אגרוז ולהפעיל את הג'ל. דמיינו את שלמות ה-RNA באמצעות מערכת תיעוד תמונות ג'ל.ראשית, להוסיף 2.5 מיקרוגרם של RNA הכולל לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של פריימר אוליגו deoxythymidine ולמלא את הצינור לנפח סופי של 13 microliters עם מים ללא גרעין. מערבבים את הדגימה וצנטריפוגה זה ב 2, 000G לדקה אחת.דגירה המדגם ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז בארבע מעלות צלזיוס לשתי דקות. לאחר מכן, להוסיף ארבעה microliters של מאגר תגובה 5X, שני microliters של תערובת dNTP ומיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך לדגימה.לאחר מכן, מערבבים את הדגימה בעדינות צנטריפוגה ב 2, 000G במשך דקה אחת. לאחר מכן, דגירה המדגם ב 45 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות, ולאחר מכן ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הוסף 7.5 מיקרוליטרים של פולימראז DNA 2X Taq ו 0.1 micromoles של RAX, לצינור מיקרו צנטריפוגה PCR.לאחר מכן, להוסיף 0.75 microliters כל אחד קדימה ולהפוך פריימר כדי להגביר את הגן CCS1. לאחר מכן, הוסף 600 ננוגרם של תבנית CDNA. צור מראש את תגובת ההגברה ב- PCR בזמן אמת כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, לנתח את הנתונים באמצעות תוכנת PCR. לשקול גרם אחד של חומר סלולרי ולארוז אותו בנייר אלומיניום. לאחר macerating המדגם, להעביר אותו בקבוקון זכוכית ולהוסיף 2.5 מיליליטר של חיץ החילוץ.לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 20, 000G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים 500 מיקרוליטרים לבקבוקונים קריוגניים. עם ספקטרופוטומטר, למדוד את ריכוז החלבון של המדגם ב 562 ננומטר באמצעות מבחן חומצה ביצינצ'ונית, עם אלבומין סריק שור כסטנדרט.ראשית, להכין את תערובת התגובה בצינור מיקרו צנטריפוגה, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להגדיל את הנפח הכולל ל 200 microliters עם 100 מילימולאר טריס HCL. זכור, זה הכרחי עבור הבטיחות שלך כדי לעקוב אחר אמצעי זהירות נאותים במהלך הכנת תערובת התגובה עם חומר רדיואקטיבי.שמור את צינור המיקרו צנטריפוגה על קרח ולהוסיף נפח של השבר המסיס, המכיל שבעה עד תשעה מיליגרם של חלבון. לאחר מכן, מערבולת את התערובת ואת הדגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות ב 11, 000G במשך חמש דקות.לאחר מכן, בזהירות לשחזר נפח של 900 microliters, ולהעביר את הדגימות לבקבוקון scintillation. לאחר מכן, להתאדות את הכלורופורם כדי להשלים יובש במכסה המנוע בטמפרטורת החדר. מוסיפים חמישה מיליליטר של נוזל תבליט לבקבוקון.לבסוף, לנתח את הרדיואקטיביות משולבת לתוך הקפאין באמצעות מונה scintillation. בפרוטוקול זה, דפוס הספיגה לקפאין נותח באמצעות צפיפות TLC, דרך ספקטרום האור הנראה, וקריאה בספיגה מקסימלית של 273 ננומטר. עקומת ההפרדה של קפאין על צלחת TLC, הראה RF בין 0.34, ו 0.39.ה- RNA הנגזר מתאים מושעים מציג הפרדות ברורות של 28, 18 ו- 5s RRNA, המציין כי הדגימות היו באיכות גבוהה. לבסוף, עקומת התכה הושגה מניתוח QPCR, מראה מוצר הגברה יחיד עבור הגן סינתאז קפאין. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביוטכנולוגיה והביוכימיה לחקור את תרבות הרקמה המשנית של חילוף החומרים מקפה, תה וקוקו.אל תשכח כי עבודה עם רדיואקטיביות ופתולוגיה מולקולרית יכולה להיות מסוכנת ביותר, ואמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות, משקפי מגן וציוד מיוחד לחומר רדיואקטיבי תמיד יילקחו בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...