Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
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हमारी प्रयोगशाला का काम Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT २१९८९३) से SMTHS को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह शोध भी CONACyT और Sistema Nacional de Investigadores (४४२२) द्वारा RJPK (No. ३७९३८) को दी फैलोशिप द्वारा समर्थित था । लेखक इस पांडुलिपि के लेखन के दौरान अपनी स्थापनाओं के उपयोग के लिए CIATEJ का धन्यवाद करते हैं । विशेष धंयवाद आणविक जीवविज्ञान अनुभाग और Valentín मेंडोज़ा Rodríguez, IFC, उणां में सभी सिफारिशों के लिए Dr. Víctor मैनुअल गोंजालेज मेंडोज़ा के लिए विस्तारित कर रहे है इस लेख के फिल्मांकन के दौरान सुविधाओं के लिए ।

1. सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन में कैफीन निष्कर्षण
<ol><li>Use C. अरेबिक सेल सस्पेंशन9. निरंतर प्रकाश (८.३ डब्ल्यू/एम2) के तहत 25 डिग्री सेल्सियस से अधिक लगातार १०० rpm को मिलाते हुए Murashige और Skoog माध्?...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

हम यहां कैफीन सामग्री, सीएस गतिविधि और प्रतिलिपि स्तर में एक में इन विट्रो संयंत्र ऊतक संस्कृति, सी. अरेबिकके सेल सस्पेंशन के रूप में मूल्यांकन के लिए इष्टतम शर्तों प्रस्तुत करते हैं । पिछले रिप...

कैफीन एक माध्यमिक metabolite कि जीनस Coffea1के पौधों द्वारा संश्लेषित है । इस उपक्षार methylxanthine परिवार के अंतर्गत आता है और एक रासायनिक संयंत्र रक्षा के रूप में माना जाता है क्योंकि यह रोगजनकों और शाकाहारी2,3के प्रतिकूल प्रभावों के खिलाफ कार्रवाई कर सकते हैं । इसके अलावा, यह metabolite कॉफी पीने के उत्तेजक गुणों, जो सामान्यतः दुनिया भर में4,5भस्म हो जाता है के लिए जिंमेदार है । इसके गुणों के कारण, कई अनुसंधान समूहों के लिए कृत्रिम मार्ग और कैफीन6,7के catabolism का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं । वर्तमान में, इन विट्रो में संयंत्र कोशिका/ऊतक संस्कृतियों विभिंन बायोटिक और अजैव रणनीतियों8,9के तहत कैफीन संचय के मूल्यांकन के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा करते हैं ।
कैफीन hydrolytic 7 की रिहाई-methylxanthine इसी ribose nucleoside से आदेश दिया N-मिथाइल के बाद 3 और 1 पदों पर शामिल है । एक विशिष्ट एस-एडेनोसिल methionine (सैम)-निर्भर N-methyltransferase (NMT) स्थिति 7 पर मिथाइल catalyzes, जबकि theobromine सिंथेस (टीएस) और सीएस 3 में शामिल है और 1-मिथाइल, क्रमशः, उत्पादन theobromine और कैफीन. अलग NMTs एंकोडिंग जीन का अध्ययन तंत्र है कि कैफीन उत्पादन10,11को विनियमित समझने की अनुमति दी है । सीएस, जो एनmethyltransferase गतिविधि है, catalyzes के पिछले दो कदम कैफीन11के कृत्रिम मार्ग । कॉफी ट्री अंकुर में, यह दिखाया गया है कि प्रकाश विकिरण सीएस गतिविधि है, जो कैफीन के संश्लेषण में वृद्धि में परिणाम को बढ़ा सकते हैं । हाल ही में, हमें पता चला है कि सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन के रखरखाव प्रकाश विकिरण के तहत प्रभाव है कि अजैव तनाव कैफीन8के कृत्रिम मार्ग को प्रभावित कारकों का उत्पादन मूल्यांकन के लिए इष्टतम स्थिति है । इन अध्ययनों में प्राप्त जानकारी में ऐसे विट्रो प्रणालियों में कैफीन जैव सिंथेटिक मार्ग के अध्ययन को अधिकतम करने के लिए चयापचय इंजीनियरिंग और सिस्टम्स जीवविज्ञान में आवेदन कर सकते हैं.
कैफीन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्राप्त करने के लाभों को देखते हुए, हम कैफीन के लिए निष्कर्षण शर्तों को अनुकूलित सी. अरेबिक एल के सेल सस्पेंशन पर यह भी एंजाइमी गतिविधि के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल विकसित करने के साथ ही Coffea कैफीन सिंथेस 1 के जीन टेप के स्तर का आकलन करने के लिए methodological कदम (CCS1) इस एंजाइम एंकोडिंग संभव था । साथ ही, हम एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट को निकालने और C. अरेबिक सेल के निलंबन में कैफीन मात्रा पतली परत क्रोमैटोग्राफी और densitometry (टीएलसी-densitometry) द्वारा ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

कैफीन (1, 3, 7-trimethylxanthine) कॉफी और चाय जैसे लोकप्रिय पेय में एक प्यूरीन उपक्षार मौजूद है । इस माध्यमिक metabolite एक रासायनिक रक्षा के रूप में माना जाता है क्योंकि यह रोगाणुरोधी गतिविधि है और एक प्राकृतिक कीटनाशक माना जाता है । कैफीन भी नकारात्मक allelopathic प्रभाव है कि आसपास के पौधों के विकास को रोकने का उत्पादन कर सकते हैं । इसके अलावा, दुनिया भर के लोग इसके एनाल्जेसिक और stimulatory इफेक्ट के लिए कैफीन का सेवन करते हैं । कैफीन के तकनीकी अनुप्रयोगों में रुचि के कारण, इस परिसर के कृत्रिम मार्ग पर अनुसंधान हो गया है । ये अध्ययन मुख्यतः जैव रासायनिक और आणविक तंत्र है कि कैफीन के जैव संश्लेषण को विनियमित समझने पर ध्यान केंद्रित किया है । इन विट्रो में ऊतक संस्कृति इस कृत्रिम मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली बन गया है । यह लेख कैफीन की ठहराव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन और जीन (CCS1) एंकोडिंग कैफीन सिंथेस (सीएस) के सेल सस्पेंशन में सी. अरेबिक एल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी गतिविधि के प्रतिलिपि के स्तर को मापने के लिए होगा ।

कैफीन अर्क यहां प्रस्तुत की प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त टीएलसी-densitometry द्वारा विश्लेषण किया गया प्लेट क्रोमैटोग्राफी के लिए नमूनों की योजना के अनुसार चित्रा 1में दिखाया गया ह?...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

कैफीन निष्कर्षण, एंजाइमी गतिविधि और संयंत्र सेल सस्पेंशन से कैफीन सिंथेस की जीन अभिव्यक्ति

यह प्रोटोकॉल सी. अरेबिक एल. के सेल सस्पेंशन में कैफीन की निकासी और ठहराव के लिए एक कुशल पद्धति का वर्णन करता है और कैफीन सिंथेस की एंजाइमी गतिविधि का अभिव्यक्ति स्तर के साथ मूल्यांकन करने के लिए एक प्रायोगिक प्रक्रिया जीन है कि इस एंजाइम सांकेतिक शब्दों में बदलना ।

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

इस विधि से विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, जैव रसायन और जैव प्रौद्योगिकी क्षेत्रों में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है । जैसे कैफीन बायोसिंथेसिस में होने वाले बदलाव क्या होते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसे कैफीन पैदा करने वाले इनविट्रो प्लांट मॉडल पर लागू किया जा सकता है।शुरू करने के लिए, लियोफिलाइज्ड कोशिकाओं में एसीटोन के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और 30 सेकंड के लिए भंवर मिक्सर के साथ मिश्रण करने से पहले फ्लास्क को सील करें। इसके बाद 100 आरपीएम पर सैंपल को कमरे के तापमान पर पांच घंटे के लिए रोटेटर के साथ मिलाएं। इसके बाद एसीटोन के 25 माइक्रोलीटर के साथ सैंपल को फिर से सस्पेंड कर दिया।सबसे पहले, सिलिका जेल प्लेटों में पहले से तैयार कैफीन निकालने का एक माइक्रोलीटर लागू करें। इसके बाद मोबाइल फेज के 10 मिलीलीटर साइक्लोहेक्सेन एसीटोन के साथ क्रोमेटोग्राफी चैंबर में टीएलसी विकसित करें। एक कॉम्पैक्ट यूवी लैंप के साथ, कम तरंग दैर्ध्य पराबैंगनी में कैफीन बैंड की कल्पना करें।इसके बाद, 273 नैनोमीटर पर घनत्व से कैफीन के स्तर की मात्रा निर्धारित करें। फिल्टर पेपर का उपयोग करके, वैक्यूम पहले से तैयार सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। फिर, तरल नाइट्रोजन और आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट के साथ सेल नमूने को मैकरेट करने के लिए एक चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार का उपयोग करें, जब तक कि यह समरूप न हो जाए।इसके बाद, नमूने के 500 माइक्रोलीटर को बाँझ माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद क्लोरोफॉर्म आइसोअमिल अल्कोहल के 300 माइक्रोलीटर और 300 माइक्रोलीटर समतुल्य फिनोल डालें। एक भंवर मिक्सर के साथ नमूना मिलाएं और इसे चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 20, 000G पर अपकेंद्रित्र करें।इसके बाद ऊपरी फेज के 300 माइक्रोलीटर को क्लीन माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें। फिर, आइसोप्रोपेनॉल के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें। गोली में इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें।फिर, 10 मिनट के लिए 12, 000G पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और तरल चरण को डिकंट करें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए नमूना सूखी। फिर, डीईपीसी-उपचारित पानी के 25 माइक्रोलीटर के साथ आरएनए निकालने को फिर से निलंबित करें।सबसे पहले, एक बाँझ माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए कुल आरएनए निकालने के दो माइक्रोग्राम जोड़ें । फिर, 10X रिएक्शन बफर का एक माइक्रोलीटर और DNase का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। डीईपीसी-उपचारित पानी के साथ 10 माइक्रोलीटर की प्रतिक्रिया की अंतिम मात्रा लाएं।फिर, एक मिनट के लिए 2, 000G पर नमूना और अपकेंद्रित्र मिलाएं। इसके बाद, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें। इसके बाद रिएक्शन को रोकने के लिए 50 माइक्रोमोलर डिसोडियम एथिलीन डायामाइन टेट्रासेटेट का एक माइक्रोलीटर डालें।10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट। फिर, एक एगरेग्लेड जेल में आरएनए के 100 नैनोग्राम लगाएं और जेल चलाएं। जेल फोटो प्रलेखन प्रणाली का उपयोग करके आरएनए की अखंडता की कल्पना करें।सबसे पहले, एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में कुल आरएनए के 2.5 माइक्रोग्राम जोड़ें। फिर, ओलिगो डिऑक्सीथिमिडीन प्राइमर का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को नाभिक मुक्त पानी के साथ 13 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में भरें। नमूना मिलाएं और इसे एक मिनट के लिए 2, 000G पर अपकेंद्रित्र करें।पांच मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट। और फिर दो मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । इसके बाद, 5X रिएक्शन बफर के चार माइक्रोलीटर, डीएनटीपी मिक्स के दो माइक्रोलीटर और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के एक माइक्रोलीटर को सैंपल में जोड़ें ।फिर, एक मिनट के लिए 2, 000G पर नमूना धीरे और अपकेंद्रित्र मिलाएं। इसके बाद, 50 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट, और फिर 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर। पीसीआर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में 2X टैक डीएनए पॉलीमरेज के 7.5 माइक्रोलीटर और रैक्स के 0.1 माइक्रोमॉल्स जोड़ें।फिर, सीसीएस1 जीन को बढ़ाने के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर में से प्रत्येक 0.75 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद सीडीएनए टेम्पलेट के 600 नैनोग्राम डालें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित वास्तविक समय पीसीआर में प्रवर्धन प्रतिक्रिया को प्रीफॉर्म करें।इसके बाद पीसीआर सॉफ्टवेयर से डाटा का विश्लेषण करें। सेलुलर सामग्री के एक ग्राम का वजन करें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी में पैक करें। नमूना को मैकरेटिंग करने के बाद, इसे एक ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें और 2.5 मिलीलीटर निष्कर्षण बफर जोड़ें।इसके बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20, 000G पर नमूना अपकेंद्रित्र । क्रायोजेनिक शीशियों में 500 माइक्रोलीटर एलिकोट्स स्थानांतरित करें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ, मानक के रूप में गोजातीय सेरिक एल्बुमिनिन के साथ, एक बाइसिनकोनिनिक एसिड परख का उपयोग करके 562 नैनोमीटर पर नमूने की प्रोटीन एकाग्रता को मापें।सबसे पहले, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार, एक माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। फिर, 100 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल के साथ कुल वॉल्यूम को 200 माइक्रोलीटर तक बढ़ाएं। याद रखें, रेडियोधर्मी सामग्री के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी के दौरान उचित सावधानियों का पालन करना आपकी अपनी सुरक्षा के लिए जरूरी है।बर्फ पर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब रखें और घुलनशील अंश की मात्रा डालें, जिसमें सात से नौ मिलीग्राम प्रोटीन होता है। इसके बाद मिश्रण को भंवर और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । इसके बाद, पांच मिनट के लिए 11, 000G पर नमूनों को अपकेंद्रित्र ।फिर, ध्यान से 900 माइक्रोलीटर की मात्रा ठीक करें, और नमूनों को प्रस्फुटन शीशी में स्थानांतरित करें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर हुड में सूखापन पूरा करने के लिए क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें। शीशी में पांच मिलीलीटर प्रस्फुटन तरल पदार्थ जोड़ें।अंत में, एक प्रस्फुटन काउंटर का उपयोग कर कैफीन में शामिल रेडियोधर्मिता का विश्लेषण करें। इस प्रोटोकॉल में, कैफीन के लिए अवशोषण के पैटर्न का विश्लेषण टीएलसी घनत्व के माध्यम से, दृश्यमान प्रकाश स्पेक्ट्रम के माध्यम से किया गया था, और 273 नैनोमीटर पर अधिकतम अवशोषण में पढ़ना था। टीएलसी प्लेट पर कैफीन के जुदाई वक्र, ०.३४ के बीच एक आरएफ दिखाया, और ०.३९ ।निलंबित कोशिकाओं से प्राप्त आरएनए 28s, 18s और 5s RRNA उपइकावाट के स्पष्ट अलगाव प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि नमूने उच्च गुणवत्ता के थे । अंत में, क्यूपीसीआर विश्लेषण से एक पिघल वक्र प्राप्त किया गया था, जिसमें कैफीन सिंथेस जीन के लिए एक प्रवर्धन उत्पाद दिखाया गया था। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने कॉफी, चाय और कोको से माध्यमिक चयापचय ऊतक संस्कृति का पता लगाने के लिए जैव प्रौद्योगिकी और जैव रसायन के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त किया।यह न भूलें कि रेडियोधर्मिता और आणविक विकृति के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय रेडियोधर्मी सामग्री के लिए दस्ताने, चश्मे और विशेष उपकरणों के उपयोग जैसी सावधानियां हमेशा ली जाएंगी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

एस 100 ए 12 की अभिव्यक्ति, शुद्धि और रोगाणुरोधी गतिविधि

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

एक नमूना से मेटाबोलाइट्स, लिपिड्स और प्रोटीन्स के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सरल भिन्नात्मक निष्कर्षण विधि

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA संयंत्र Protoplasts से इंटरैक्टियम कैद

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

संशोधित Baculovirus अभिव्यक्ति वैक्टर कीट कोशिकाओं में स्रावित संयंत्र प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सिट्रेट सिंथासे गतिविधि का एक कोलोरीमेट्रिक परख

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

एंजाइमी उत्पादन और Diterpenoid प्राकृतिक उत्पादों के शोधन के लिए एक अनुकूलन दृष्टिकोण

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए संशोधित विधि द्वारा अनाज बीजों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोम डेटा प्राप्त करना

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

सक्स-एचपीएलसी का उपयोग करके विभिन्न पौधों की प्रजातियों से घुलनशील, रेडियोलेबल इनोसिटोल पॉलीफॉस्फेट का निष्कर्षण और क्वांटिफिकेशन

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

पीसीआर म्यूटेनेसिस, क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, फास्ट प्रोटीन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल और वाइल्ड टाइप का क्रिस्टलीकरण और ट्रिप्टोफान सिंथेस के उत्परिवर्ती रूप

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...