Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Il lavoro del nostro laboratorio è stato finanziato da una sovvenzione del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a SMTHS. Questa ricerca è stata sostenuta anche da una borsa di studio concessa a RJPK (No. 37938) da CONACyT e il Sistema Nacional de Investigadores (4422). Gli autori ringraziano CIATEJ per l'uso dei suoi impianti durante la scrittura di questo manoscritto. Un ringraziamento speciale è estesi a Dr. Víctor Manuel González Mendoza per tutti i consigli nella sezione di biologia molecolare e Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM per le strutture durante le riprese di questo articolo.

1. caffeina estrazione in sospensioni di cellule di c. arabica L.
<ol><li>Utilizzare c. arabica cella sospensioni9. Mantenere le sospensioni da sottoculture bisettimanale nel mezzo di Murashige e Skoog a pH 4,3 con 100rpm costante agitazione a 25 ° C sotto luce continua (8.3 W/m2).</li>
	<li>Raccogliere le cellule sotto vuoto filtrazione utilizzando 11 µm poro carta da filtro e un imbuto di Buchner.</li>
	<li>Registrare il peso fresco delle cellule raccolte utilizz...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Vi presentiamo qui le condizioni ottimali per la valutazione del contenuto di caffeina, livelli di attività e trascrizione di CS in un in vitro pianta coltura tissutale, quali sospensioni di cellule di c. arabica. I rapporti precedenti hanno confermato che le celle mantenendo sotto irradiazione di luce e in presenza di teobromina nel terreno di coltura sono parametri adatti per aumentare il livello di caffeina, che permette di valutare i metodi di separazione di caffeina mediante cromatografia liquida ...

La caffeina è un metabolita secondario che è biosynthesized da piante del genere Coffea1. Questo alcaloide appartiene alla famiglia delle metilxantine ed è considerato come una difesa di impianto chimico perché può agire contro gli effetti contrari di agenti patogeni ed erbivori2,3. Inoltre, questo metabolita è responsabile per le proprietà stimolanti della bevanda caffè, che è comunemente consumato in tutto il mondo4,5. Grazie alle sue proprietà, diversi gruppi di ricerca sono interessati a studiare la via biosintetica e catabolismo di caffeina6,7. Attualmente, colture di vegetali in vitro cellule/tessuti servono come un'alternativa per la valutazione di accumulo di caffeina sotto varie strategie biotici e abiotici8,9.
Biosintesi di caffeina coinvolge il rilascio idrolitico di 7-methylxanthine dai nucleosidici ribosio corrispondente seguito da ordinato N-iperomocisteinemici nelle posizioni 3 e 1. Una specifico S- adenosil metionina (SAM)-dipendente N-metiltransferasi (NMT) catalizza la metilazione in posizione 7, considerando che la teobromina sintetasi (TS) e CS sono coinvolti in 3 e 1 iperomocisteinemici rispettivamente, producendo teobromina e caffeina. Lo studio dei geni che codificano distinti NMTs ha permesso la comprensione del meccanismo che regola la caffeina produzione10,11. CS, che ha attività di N -metiltransferasi, catalizza gli ultimi due passaggi della via biosintetica di caffeina11. Nei semenzali di pianta del caffè, ha dimostrato che la radiazione luminosa può aumentare attività di CS, che si traduce in un aumento della biosintesi di caffeina. Recentemente, abbiamo dimostrato che il mantenimento delle sospensioni di cellule di c. arabica L. sotto irradiazione di luce è la condizione ottima per valutare gli effetti che producono fattori di stress abiotici che influenzano la via biosintetica di caffeina8. Le informazioni ottenute in questi studi possono avere applicazioni in biologia di ingegneria e sistemi metabolica per massimizzare lo studio della via biosintetica caffeina in tali sistemi in vitro .
Considerati i vantaggi di ottenere un modello adatto per lo studio della biosintesi di caffeina, abbiamo ottimizzato le condizioni di estrazione di caffeina su sospensioni di cellule di c. arabica L. È stato anche possibile sviluppare un protocollo utile per studiare l'attività enzimatica, nonché passaggi metodologici per valutare il livello delle trascrizioni del gene di Coffea caffeina sintasi 1 (CCS1) codifica per questo enzima. Qui, segnaliamo un protocollo per estrarre e quantificare la caffeina in sospensioni di cellule di c. arabica da cromatografia di strato sottile e densitometria (TLC-densitometria).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

(1,3,7-trimetilxantina) la caffeina è un alcaloide della purina presente nelle popolari bevande quali caffè e tè. Questo metabolita secondario è considerato come una difesa chimica perché ha attività antimicrobica ed è considerato un insetticida naturale. La caffeina può anche produrre effetti negativi allelopatiche che impediscono la crescita di piante circostanti. Inoltre, persone in tutto il mondo consumano caffeina per i suoi effetti analgesici e stimolatori. A causa di interesse per le applicazioni tecnologiche di caffeina, ricerca sulla via biosintetica di questo composto è cresciuta. Questi studi si sono concentrati principalmente sulla comprensione dei meccanismi biochimici e molecolari che regolano la biosintesi di caffeina. Coltura in vitro del tessuto è diventato un sistema utile per lo studio di questa via biosintetica. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la quantificazione di caffeina e per misurare i livelli di trascrizione del gene (CCS1) codifica caffeina sintasi (CS) in sospensioni di cellule di c. arabica L., come pure la sua attività.

Gli estratti di caffeina ottenuti tramite il processo qui presentato sono stati analizzati da TLC-densitometria sottoponendo i campioni per piastra cromatografia secondo lo schema illustrato nella Figura 1. Per quantificare i livelli di caffeina in estratti delle cellule, una curva con varie concentrazioni di standard commerciali per questo composto è stato utilizzato (Figura 2A). Il modello di assorbanza per la caffeina è stat...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali

Questo protocollo descrive una metodologia efficace per l'estrazione e la quantificazione di caffeina in sospensioni cellulari di L. c. arabica e un processo sperimentale per valutare l'attività enzimatica della sintasi di caffeina con il livello di espressione il gene che codifica per questo enzima.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei settori della chimica analitica, della biochimica e della biotecnologia. Ad esempio, quali sono i cambiamenti che si verificano nella biosintesi della caffeina. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che può essere applicato a modelli di piante di invitro che producono caffeina.Per iniziare, aggiungere 10 millilitri di acetone alle cellule lyophilized e sigillare il pallone prima di mescolare con il miscelatore a vortice per 30 secondi. Quindi, mescolare il campione a 100 giri/min con un rotatore per cinque ore a temperatura ambiente. Successivamente, sospendere di nuovo il campione con 25 microlitri di acetone.In primo luogo, applicare un microlitro dell'estratto di caffeina precedentemente preparato sulle piastre di gel di silice. Quindi, sviluppare il TLC nella camera cromatografica con 10 millilitri della fase mobile, cicloesano acetone. Visualizza le bande di caffeina in ultravioletto a lunghezza d'onda corta, con una lampada UV compatta.Successivamente, quantificare i livelli di caffeina per densitometria a 273 nanometri. Utilizzando carta da filtro, filtrare sottovuoto le sospensioni cellulari precedentemente preparate. Quindi, utilizzare una malta di porcellana per macerare il campione di cellule, con azoto liquido e reagente di isolamento dell'RNA, fino a quando non viene omogeneizzato.Successivamente, trasferire 500 microlitri del campione in un tubo sterile di micro centrifuga. Quindi, aggiungere 300 microlitri di alcol isoamlico cloroformio e 300 microlitri di fenolo equilibrato. Mescolare il campione con un miscelatore a vortice e centrifugarlo a 20.000G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, trasferire 300 microlitri della fase superiore in un tubo di micro centrifuga pulito. Quindi, aggiungere 200 microlitri di isopropanolo e incubare il tubo per un'ora a -20 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di etanolo al pellet.Quindi, centrifugare il tubo a 12.000G per 10 minuti e decantare la fase liquida. Quindi, asciugare il campione per 1,5 ore a temperatura ambiente. Quindi, sospendere di nuovo l'estratto di RNA con 25 microlitri di acqua trattata con DEPC.In primo luogo, aggiungere due microgrammi di estratto totale di RNA a un tubo sterile di micro centrifuga. Quindi, aggiungere un microlitro di tampone di reazione 10X e un microlitro di DNasi. Portare il volume finale della reazione a 10 microlitri con acqua trattata con DEPC.Quindi, mescolare il campione e la centrifuga a 2.000G per un minuto. Successivamente, incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere un microlitro di 50 tetraacetato di disodico di etilene disodico micromolare, per interrompere la reazione.Incubare il campione a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, applicare 100 nanogrammi di RNA su un gel di agarosio ed eseguire il gel. Visualizza l'integrità dell'RNA utilizzando un sistema di documentazione fotografica in gel.In primo luogo, aggiungere 2,5 microgrammi di RNA totale a un tubo di micro centrifuga. Quindi, aggiungere un microlitro di primer oligo deossitimidina e riempire il tubo a un volume finale di 13 microlitri con acqua priva di nucleasi. Mescolare il campione e centrifugarlo a 2.000G per un minuto.Incubare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti. E poi a quattro gradi Celsius per due minuti. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di tampone di reazione 5X, due microlitri di miscela dNTP e un microlitro di transcriptasi inversa al campione.Quindi, mescolare delicatamente il campione e centrifugare a 2.000G per un minuto. Dopo questo, incubare il campione a 45 gradi Celsius per 50 minuti, quindi a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 7,5 microlitri di 2X Taq DNA polimerasi e 0,1 micromoli di RAX, a un tubo di micro centrifuga PCR.Quindi, aggiungere 0,75 microlitri ciascuno di primer avanti e indietro per amplificare il gene CCS1. Successivamente, aggiungere 600 nanogrammi di modello CDNA. Preformare la reazione di amplificazione in tempo reale PCR come descritto nel protocollo di testo.Quindi, analizzare i dati con il software PCR. Pesare un grammo di materiale cellulare e imballarlo in un foglio di alluminio. Dopo aver macerato il campione, trasferirlo su una fiala di vetro e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di estrazione.Quindi, centrifuga il campione a 20.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 500 aliquote microlitri in flaconcini criogenici. Con uno spettrofotometro, misurare la concentrazione proteica del campione a 562 nanometri utilizzando un saggio di acido bicinchoninico, con l'albumina serica bovina come standard.In primo luogo, preparare la miscela di reazione in un tubo di micro centrifuga, secondo il protocollo di testo. Quindi, aumentare il volume totale a 200 microlitri con tris HCL da 100 millimolare. Ricorda, è imperativo per la tua sicurezza seguire le dovute precauzioni durante la preparazione della miscela di reazione con materiale radioattivo.Mantenere il tubo di micro centrifuga sul ghiaccio e aggiungere un volume della frazione solubile, contenente da sette a nove milligrammi di proteine. Quindi, vortice la miscela e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, centrifugare i campioni a 11.000G per cinque minuti.Quindi, recuperare attentamente un volume di 900 microlitri e trasferire i campioni in una fiala a scintillazione. Successivamente, evaporare il cloroformio per completare la secchezza nel cappuccio a temperatura ambiente. Aggiungere cinque millilitri di liquido di scintillazione al flaconcino.Infine, analizzare la radioattività incorporata nella caffeina utilizzando un contatore di scintillazione. In questo protocollo, il modello di assorbanza per la caffeina è stato analizzato tramite densitometria TLC, attraverso lo spettro della luce visibile, e leggendo in massimo assorbimento a 273 nanometri. La curva di separazione della caffeina sulla piastra TLC, ha mostrato una RF compresa tra 0,34 e 0,39.L'RNA derivato da cellule sospese mostra chiare separazioni delle subunità di RRNA 28s, 18s e 5s, indicando che i campioni erano di alta qualità. Infine, una curva di fusione è stata ottenuta dall'analisi QPCR, mostrando un singolo prodotto di amplificazione per il gene della caffeina sintasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della biotecnologia e della biochimica per esplorare la coltura secondaria dei tessuti metabolizzante da caffè, tè e cocco.Non dimenticare che lavorare con la radioattività e la patologia molecolare può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di guanti, occhiali e attrezzature speciali per materiale radioattivo devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Ricerca

Biochimica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

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Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

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Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

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Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Estrazione e quantificazione di Polifosfati Inostoti a inositolo radioeti da diverse specie vegetali che utilizzano SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...