Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

当研究室の仕事は、SMTHS に国立ナシオナル デ サイエンス y テクノロジー (CONACyT 219893) からの助成金によって賄われていた。この研究も、CONACyT、システマー ナシオナル ・ デ ・ Investigadores (4422) で RJPK (号 37938) に与えられる奨学金によって支えられました。著者は、この原稿の執筆の間に、そのインストールの使用のため CIATEJ をありがちましょう。特別な感謝は、この記事の撮影中に施設の分子生物学セクションとバレンティン メンドーサ ・ ロドリゲス、IFC、UNAM のすべての推薦の博士ビクター マヌエル ・ ゴンサレス ・ メンドーサまで延長されます。

1. カフェインアラビカの c. l. の細胞懸濁液の抽出
<ol><li>C. アラビカ細胞懸濁液9を使用します。連続光 (8.3 W/m2) の下で 25 の ° C で揺れ定数 100 rpm と ph 4.3 培地、培培地で隔週のサブカルチャが懸濁液を維持します。</li>
	<li>11 μ m 孔フィルター紙とブフナーを使って吸引ろ過の下のセルを収穫します。</li>
	<li>スケールを使用してください集められたセ?...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

カフェイン コンテンツを評価するための最適の条件をここで提案する、CS 活動とトラン スクリプト レベルの体外植物ティッシュ文化、成木の細胞懸濁液など。以前のレポートは、カフェイン成分分離手法を評価することが可能となって、カフェインのレベルを高めるための適切なパラメーターを維持する細胞と培養液中のテオブロミンの存在下で光照射下におけるには確認し?...

カフェインは、コーヒーノキ1属の植物によって生合成される二次代謝産物です。このアルカロイドはメチルキサンチンのファミリーに属するし、は病原体と植食者の2,3の悪影響に対して振舞うことだから化学プラント防衛とみなされます。さらに、この代謝物は、コーヒーを飲む、一般的に消費されて世界4,5である刺激的な特性を担います。その特性のためいくつかの研究グループは、生合成経路とカフェイン6、7の異化作用の勉強に興味があります。現在、植物培養細胞・組織培養は、様々 な生物的・非生物的戦略8,9カフェイン蓄積の評価のための代替として機能します。
カフェイン合成には順序N続く対応するリボース ヌクレオシドから 7 メチルキサンチンの加水分解のリリースが含まれます-3 と 1 の位置でメチル化。特定Ss-アデノシルメチオニン (SAM)-依存 N-メチルトランスフェラーゼ (NMT) に対し位置 7、メチル化を触媒するテオブロミン合成酵素 (TS) CS が関与しているの 3-、1-メチル化、それぞれ、テオブロミンを生産し、カフェイン。明確な NMTs をコードする遺伝子の研究は、カフェイン生産10,11を調節するメカニズムを理解することを許可しています。N-メチルトランスフェラーゼ活性である CS カフェイン11の生合成経路の最後の 2 つのステップを触媒します。コーヒーの木の苗の光放射がカフェイン生合成の増加で起因する CS 活動を増やすことができますが示されています。最近では、光照射下で、成木L. 細胞懸濁液の保守がカフェイン8の生合成経路に影響を与える非生物的ストレス要因を作り出す効果を評価するための最適な条件であることを示した。これらの研究で得られた情報は、このような培養システムでカフェインの生合成経路の研究を最大化するため代謝工学とシステム生物学のアプリケーションにあります。
アラビカの c. l. の細胞懸濁液にカフェインの抽出条件を最適化カフェイン生合成の研究のための適切なモデルを得ることの利点を考えると、また、コーヒーノキカフェイン合成酵素 1 (CCS1) この酵素の遺伝子転写のレベルを評価するための方法論的手順と同様に、酵素活性を研究するための有用なプロトコルを開発することが可能だった。症例を抽出し、薄層クロマトグラフィー (TLC デンシトメトリー) デンシトメトリーによって成木細胞懸濁液にカフェインを定量化するためのプロトコル。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

カフェイン (1,3,7-トリメチルキサンチン) はコーヒーやお茶など人気のある飲み物でプリン アルカロイドです。この二次代謝産物は、抗菌作用があり、自然な殺虫剤であるので化学防衛とみなされます。カフェインは、周囲の植物の成長を防ぐ負のアレロパシー効果を生成できます。さらに、世界中の人々 はその鎮痛剤と促進の効果のためのカフェインを消費します。ためにカフェインの技術のアプリケーションの関心は、この化合物の生合成経路の研究は成長しています。これらの研究は、カフェインの生合成を調節する生化学的および分子メカニズムの理解に主に焦点を当てています。体外培養は、この生合成経路を研究するための便利なシステムになっています。この記事は、その活動と同様、l. c. のアラビカ種の細胞懸濁液にカフェインの定量化のためのカフェイン合成酵素 (CS) をエンコード (CCS1) 遺伝子の転写レベルを測定手順プロトコルを説明します。

カフェイン抽出物紹介プロセスを介して取得は、図 1に示すスキームに従ってプレートクロマトグラフィにサンプルをかけることによって TLC デンシトメトリーによって分析されました。この化合物は商業標準の様々 な濃度の細胞抽出液のカフェイン、カーブのレベルを定量化するには、(図 2 a) を使用します。カフェイン?...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

このプロトコルは、抽出と成木L の細胞懸濁液中のカフェインの定量のための効率的な方法論と表現レベルのカフェイン合成酵素の酵素活性を評価するための実験的プロセスについて説明します。この酵素を符号化する遺伝子。

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

この方法は、分析化学、生化学、バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。カフェイン生合成に起こる変化はどのようなものである。この技術の主な利点は、カフェインを産生するインビトロ植物モデルに適用できることである。まず、凍結乾燥した細胞に10ミリリットルのアセトンを加え、フラスコを密封してからボルテックスミキサーと30秒間混合します。次に、100rpmで試料を室温で5時間回転器と混合する。この後、25マイクロリットルのアセトンでサンプルを再懸濁する。まず、前に調製したカフェイン抽出物の1マイクロリットルをシリカゲルプレートに塗布する。次いで、移動相の10ミリリットルのクロマトグラフィーチャンバー、シクロヘキサンアセトンでTLCを開発する。コンパクトなUVランプで、短波長の紫外線でカフェインバンドを視覚化します。この後、273ナノメートルの密度測定でカフェインレベルを定量化します。ろ紙を用いて、以前に調製した細胞懸濁液を真空濾過する。次いで、磁器モルタルを使用して、液体窒素およびRNA単離試薬を用いて、均質化されるまで細胞試料を浸食する。次に、サンプル500マイクロリットルを無菌マイクロ遠心管に移す。次いで、クロロホルムイソアミルアルコールの300マイクロリットル、および平衡フェノールの300マイクロリットルを加える。渦ミキサーでサンプルを混ぜ、20,000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。この後、上相の300マイクロリットルをきれいなマイクロ遠心管に移す。その後、イソプロパノールの200マイクロリットルを追加し、マイナス20°Cで1時間チューブをインキュベートします。ペレットに1ミリリットルのエタノールを加えます。次いで、チューブを12,000Gで10分間遠心し、液相をデカン化する。次に、試料を室温で1.5時間乾燥させます。次いで、25マイクロリットルのDEPC処理水でRNA抽出物を再中断する。まず、全RNA抽出物の2マイクログラムを無菌マイクロ遠心管に加えます。次に、10X反応バッファーの1マイクロリットルとDNaseの1マイクロリットルを加えます。DEPC処理水で10マイクロリットルに反応の最終容積を持って来なさい。その後、サンプルと遠心分離機を2,000Gで1分間混ぜます。次に、37°Cで30分間インキュベートします。この後、50ミクロモル二ナトリウムの1マイクロリットルをエチレンジアミンテトラセテートを加え、反応を停止させた。サンプルを摂氏65度で10分間インキュベートします。次に、アガロースゲルに100ナノグラムのRNAを塗布し、ゲルを実行します。ゲル写真ドキュメンテーションシステムを使用してRNAの完全性を可視化します。まず、マイクロ遠心分離管に合計RNAの2.5マイクログラムを加えます。次に、オリゴデオキシチミジンプライマーを1マイクロリットル加え、ヌクレアーゼを含まない水でチューブを13マイクロリットルの最終体積に充填します。サンプルを混ぜ、2,000Gで遠心分離機を1分間混ぜます。サンプルを摂氏65度で5分間インキュベートします。そして、2分間摂氏4度で。次に、5X反応バッファーの4マイクロリットル、dNTPミックスの2マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルに加える。その後、サンプルを2,000Gで1分間軽く遠心分離機で混ぜます。この後、サンプルを摂氏45度で50分間インキュベートし、摂氏70度で10分間インキュベートします。7.5マイクロリットルの2X Taq DNAポリメラーゼと0.1マイクロモルのRAXを、PCRマイクロ遠心チューブに加えます。次に、各フォワードおよびリバースプライマーを0.75マイクロリットル加え、CCS1遺伝子を増幅する。その後、600 ナノグラムの CDNA テンプレートを追加します。テキストプロトコルに記載されているように、増幅反応をリアルタイムPCRでプリフォームする。次に、PCR ソフトウェアを使用してデータを分析します。細胞材料の1グラムを計量し、アルミホイルでそれをパックします。サンプルを浸食した後、ガラスバイアルに移し、2.5ミリリットルの抽出バッファーを加えます。次に、試料を摂氏4度で20分間20,000Gで遠心分離する。500マイクロリットルのアリコートを極低温バイアルに移す。分光光度計を用いて、ビチンコニン酸アッセイを用いて562ナノメートルのサンプルのタンパク質濃度を測定し、牛セリックアルブミンを標準にします。まず、テキストプロトコルに従って、マイクロ遠心分離管で反応混合物を調製する。その後、100 ミリモルトリス HCL で合計体積を 200 マイクロリットルに増やします。放射性物質との反応混合物の調製中に、あなた自身の安全が適切な予防措置に従うことを覚えておいてください。氷の上にマイクロ遠心チューブを維持し、タンパク質の7〜9ミリグラムを含む可溶性分画の体積を追加します。その後、混合物をボルテックスし、30分間摂氏30度でインキュベートする。この後、サンプルを11,000Gで5分間遠心する。次に、900マイクロリットルの体積を慎重に回収し、サンプルをシンチレーションバイアルに移す。次に、クロロホルムを蒸発させて、室温でボンネット内の乾燥を完了します。バイアルに5ミリリットルのシンチレーション液を加えます。最後に、シンチレーションカウンターを用いてカフェインに組み込まれた放射能を分析する。このプロトコルでは、カフェインの吸光度のパターンをTLC濃度測定を介して分析し、可視光スペクトルを介して、273ナノメートルで最大吸収で読み取った。TLCプレート上のカフェインの分離曲線は、0.34、および0.39の間のRFを示した。懸濁細胞由来のRNAは、28、18および5s RRNAサブユニットの明確な分離を示し、サンプルが高品質であることを示す。最後に、QPCR分析からメルト曲線を得て、カフェイン合成酵素遺伝子に対する単一の増幅産物を示した。その開発後、この技術は、バイオテクノロジーと生化学の分野の研究者がコーヒー、紅茶、ココから二次代謝組織培養を探求する道を開きました。放射能や分子病理学を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋、ゴーグル、放射性物質の特別な機器の使用などの予防措置を常に講じなければならないことを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...