Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
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우리 연구소의 작품 SMTHS 하 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 219893)에서 교부 금에 의해 투자 되었다. 이 연구 또한 CONACyT와 시스테 나시오날 드 Investigadores (4422) RJPK (No. 37938)을 부여한 장학금에 의해 지원 되었다. 저자는이 원고를 작성 하는 동안 그것의 설치의 사용에 대 한 CIATEJ를 감사합니다. 특별 감사 박사 빅토르 마누엘 곤살레스 멘도사 시설에 대 한 분자 생물학 섹션 및 발렌틴 멘도사 로드리게스, IFC, UNAM에서 모든 권장 사항에 대 한이 문서의 촬영 기간 동안 연장 됩니다.

1. C. arabica L.의 셀 정지에서 카페인 추출
<ol><li>C. arabica 셀 정지9를 사용 합니다. 연속 광원 (8.3 W/m2) 25 ° C에서 흔들어 상수 100 rpm 격주 비주류 pH 4.3에서 Skoog와 村 重 매체에 의해 정지를 유지 합니다.</li>
	<li>11 µ m 기 공 필터 종이 부 흐 너 깔때기를 사용 하 여 진공 여과에서 세포를 수확.</li>
	<li>등록 규모를 사용 하 여 수집 된 셀의 신선한 무게, 알루미늄 ...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

우리가 현재 여기 카페인 콘텐츠를 평가 하기 위한 최적의 조건, CS 활동 및 수준에서 생체 외에서 식물 조직 배양, C. arabica의 셀 정지 등. 이전 보고서 유지 셀 빛 조사 하 고 문화 매체에 테오 브로민 제제의 존재는 카페인, 카페인 분리 방법을 평가 수의 수준을 높이기 위한 적합 한 매개 변수 확인 반전 단계 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC RP)를 사용 하 여. 현재, 셀 정지 생 합성 카페...

카페인은 이다 biosynthesized Coffea1속의 식물 이차 대사 산물. 이 알칼로이드 methylxanthine 가족에 속하는 그리고 그것 병원 체와 herbivores2,3의 부작용에 대 한 역할을 할 수 있기 때문에 화학 공장으로 간주 됩니다. 또한,이 대사 산물은 일반적으로 소모한 전세계4,5커피 음료의 자극 속성에 대 한 책임. 그것의 속성으로 인해 여러 연구 그룹 생 합성 통로 카페인6,7의 놓을 공부에 관심이. 현재, 식물 체 외에서 세포/조직 문화 다양 한 생물과 비 생물 적인 전략8,9에서 카페인 축적을 평가 하기 위한 대체 역할을 합니다.
카페인 생 합성 포함 다음 주문된 N해당 ribose nucleoside에서 7 methylxanthine의 가수분해 릴리스-3-1 위치에서 methylations. 특정 S-adenosyl 메티오닌 (SAM)-종속 N-methyltransferase (NMT) 반면 7, 위치에 메 틸 화를 catalyzes 브로민 synthase (TS) 및 CS 관련에 3-고 1-methylations, 각각, 테오 브로민 제제 생산 및 카페인입니다. 고유한 NMTs를 인코딩 하는 유전자의 연구는 카페인 생산10,11을 조절 하는 메커니즘을 이해 수 있다. N-methyltransferase 활동이 CS 카페인11의 생 합성 통로의 마지막 두 단계를 catalyzes. 커피 나무 묘 목에 그것 보였다 빛 방사선 카페인 생 합성 증가 귀착되는 CS 활동을 증가할 수 있다. 최근에, 우리는 가벼운 방사선 조사에서 C. arabica L.의 셀 정지의 유지 보수는 abiotic 스트레스 요인을 카페인8의 생 합성 통로 영향을 미치는 생산 효과 평가 하기 위한 최적의 조건을 보였다. 이러한 연구에서 얻은 정보 같은 생체 외에서 시스템에 카페인 생 합성 통로의 연구를 극대화 하기 위한 대사 공학 및 시스템 생물학에 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
카페인 생 합성의 연구에 대 한 적합 한 모델의 장점을 감안할 때, 우리 C. arabica L. 셀 정지에 카페인 추출 조건 최적화 그것은 또한 유전자 사본 Coffea 카페인 synthase 1 (CCS1) 인코딩이 효소의 수준을 평가 하기 위한 방법론 단계 뿐만 아니라 효소 활동 공부에 대 한 유용한 프로토콜을 개발할 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 하 고 얇은 층 크로마토그래피와 densitometry (TLC densitometry) C. arabica 셀 정지에 카페인을 계량 프로토콜을 보고 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

카페인 (1,3,7-trimethylxanthine)은 커피와 차 등 인기 있는 음료에는 퓨 린 알칼로이드 이다. 항균 성 활동은 자연 살충제로 간주 됩니다 때문에이 2 차 대사 산물 화학 방어로 간주 됩니다. 카페인 또한 주변 식물의 성장을 방지 하는 부정적인 allelopathic 효과 생성할 수 있습니다. 또한, 전 세계의 사람들이 그것의 진통 및 stimulatory 효과 대 한 카페인 소비. 때문에 카페인의 기술 응용 프로그램에 대 한 관심,이 화합물의 생 합성 통로 대 한 연구는 성장 했다. 이러한 연구는 카페인의 생 합성을 조절 하는 생 화 학적 및 분자 메커니즘을 이해에 주로 집중 했다. 조직 문화를 체 외에서 이 생 합성 통로 공부에 대 한 유용한 시스템 되고있다. 이 문서는 C. arabica L. 그것의 활동의 셀 정지에 카페인 synthase (CS) 인코딩 유전자 (CCS1)의 증명서 수준 측정에 대 한 카페인의 정량화에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

여기에 제시 된 과정을 통해 얻은 카페인 추출 쓰는 그림 1에 표시 된 스키마에 따라 착 색 인쇄기 격판덮개를 샘플 하 여 TLC densitometry에 의해 분석 되었다. 이 화합물은 상업 표준의 다양 한 농도와 세포 추출 물에는 카페인, 곡선의 수준을 계량 (그림 2A)를 사용 합니다. 카페인에 대 한 흡 광도의 패턴 가시 광선 스펙트럼 (UV-VI) ...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

이 방법은 분석 화학, 생화학 및 생명 공학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 카페인 생합성에서 발생하는 변화는 무엇입니까. 이 기술의 주요 장점은 카페인을 생산하는 인비트로 식물 모델에 적용 될 수 있다는 것입니다.시작하려면, lyophilized 세포에 아세톤의 10 밀리리터를 추가하고 30 초 동안 소용돌이 믹서와 혼합하기 전에 플라스크를 밀봉. 그런 다음 100 rpm에서 실온에서 5 시간 동안 회전기와 샘플을 혼합합니다. 그 후, 아세톤의 25 마이크로리터로 샘플을 다시 중단한다.먼저 이전에 준비된 카페인 추출물의 마이크로리터 1개를 실리카 젤 플레이트에 바부합니다. 이어서, 발동상, 사이클로헥산 아세톤의 10밀리리터를 가진 크로마토그래피 챔버에서 TLC를 개발한다. 컴팩트한 UV 램프로 짧은 파장 자외선으로 카페인 밴드를 시각화합니다.그 후, 273 나노미터에서 밀도에 의해 카페인 수준을 정량화. 필터 용지를 사용하여 이전에 준비된 셀 서스펜션을 진공 필터로 사용합니다. 이어서, 도자기 박격포를 사용하여 액체 질소 및 RNA 격리 시약으로 세포 샘플을 균질화할 때까지 메이케레이트한다.다음으로, 시료의 500마이크로리터를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 클로로폼 이소아밀 알코올 300 마이크로리터와 평형 페놀의 마이크로리터 300을 추가합니다. 샘플을 섭류 믹서와 원심분리기와 혼합하여 섭씨 4도에서 15분간 20, 000G로 섞습니다.그 후, 상부상 마이크로리터 300마이크로리터를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 이송한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 이소프로판올을 추가하고 음의 섭씨 20도에서 1 시간 동안 튜브를 배양합니다. 펠릿에 에탄올 1밀리리터를 넣습니다.이어서, 12, 000G에서 튜브를 원심분리하고 10분 동안 액체 상을 감소시한다. 다음으로 실온에서 1.5시간 동안 시료를 건조시합니다. 이어서, DEPC 처리된 물의 25마이크로리터로 RNA 추출물을 다시 중단한다.먼저 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 추출물 2마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 10X 반응 버퍼의 마이크로리터 1개와 DNase의 마이크로리터 1개를 추가합니다. DEPC 처리 된 물로 10 마이크로 리터에 반응의 최종 볼륨을 가져옵니다.그런 다음 시료와 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞는다. 다음으로 샘플을 섭씨 37도에서 30분간 배양합니다. 그 후, 50 마이크로몰라 디소이소르 에틸렌 디아민 테트라아세테이트의 1개의 마이크로리터를 추가하여 반응을 중단합니다.샘플을 섭씨 65도에서 10분간 배양합니다. 그런 다음 아가로즈 젤에 100 나노그램의 RNA를 적용하고 젤을 실행합니다. 젤 사진 문서화 시스템을 사용하여 RNA의 무결성을 시각화합니다.첫째, 마이크로 원심분리기 튜브에 총 RNA 2.5 마이크로그램을 추가합니다. 그런 다음 올리고 데옥시티미드 프라이머의 마이크로리터 1개를 추가하고 뉴클레아제 없는 물로 13마이크로리터의 최종 부피에 튜브를 채웁니다. 샘플을 혼합하고 원심분리기를 2, 000G에서 1분간 섞습니다.샘플을 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 그리고 2 분 동안 섭씨 4도에서. 다음으로, 5X 반응 버퍼의 4개의 마이크로리터, dNTP 믹스의 2개의 마이크로리터 및 시료에 역 전사제 1개를 추가합니다.그런 다음 샘플을 2, 000G에서 1분 동안 부드럽게 섞습니다. 그 후 샘플을 섭씨 45도에서 50분간 배양한 다음 섭씨 70도에서 10분간 배양합니다. PCR 마이크로 원심분리기 튜브에 2X Taq DNA 폴리머라제 7.5 마이크로리터와 RAX 0.1 마이크로몰레를 추가합니다.그런 다음 CCS1 유전자를 증폭시키기 위해 각각 0.75 마이크로리터를 앞뒤로 프라이머를 첨가합니다. 이 후, 추가 600 CDNA 템플릿의 나노 그램. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실시간으로 증폭 반응을 preform.그런 다음 PCR 소프트웨어로 데이터를 분석합니다. 셀룰러 재료 1 그램을 계량하고 알루미늄 호일에 포장하십시오. 샘플을 추출한 후 유리 바이알로 옮기고 2.5 밀리리터의 추출 버퍼를 추가합니다.다음으로, 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 20, 000G에서 원심분리합니다. 500 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 극저온 바이알로 옮기. 분광광계를 사용하여, 소 세릭 알부민을 표준으로 사용하여 562 나노미터에서 시료의 단백질 농도를 측정합니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 마이크로 원심분리기 튜브에서 반응 혼합물을 준비한다. 그런 다음 총 부피를 100 밀리머 트리 HCL로 200 마이크로리터로 늘립니다. 방사성 물질과의 반응 혼합물을 준비하는 동안 자신의 안전이 적절한 예방 조치를 따르는 것이 필수적이라는 것을 기억하십시오.마이크로 원심 분리기 튜브를 얼음에 보관하고 7~9밀리그램의 단백질을 함유한 수용성 분획의 양을 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 소용돌이쳐 30°C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후 샘플을 11, 000G에서 5분간 원심분리합니다.이어서, 900 마이크로리터의 부피를 조심스럽게 회수하고, 샘플을 신자극 병으로 옮는다. 다음으로, 실온에서 후드의 건조를 완료하기 위해 클로로폼을 증발시다. 바이알에 5밀리리터의 신경유를 추가합니다.마지막으로, 신경화 카운터를 사용하여 카페인에 통합된 방사능을 분석합니다. 이 프로토콜에서, 카페인에 대한 흡광도의 패턴은 TLC 밀도를 통해, 가시광 스펙트럼을 통해, 273 나노미터에서 최대 흡수로 판독되었다. TLC 플레이트에 카페인의 분리 곡선은 0.34에서 0.39 사이의 RF를 보였다.중단된 세포에서 유래된 RNA는 28s, 18s 및 5s RRNA 서브유닛의 명확한 분리를 나타내며, 이는 샘플이 고품질임을 나타낸다. 마지막으로, 카페인 신체 유전자에 대한 단일 증폭 생성물을 보여주는 QPCR 분석에서 용융 곡선을 얻었다. 개발 후, 이 기술은 커피, 차 및 코코에서 이차 대사 조직 문화를 탐구하는 생명 공학 및 생화학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.방사능 및 분자 병리학을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 방사성 물질에 대한 장갑, 고글 및 특수 장비의 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

연구

생화학

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

SAX-HPLC를 사용하여 다른 식물 종에서 용해성, 방사성 라벨이 붙은 이노시톨 폴리인산염의 추출 및 정량화

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...