Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Arbeidet med vårt laboratorium ble finansiert av en bevilgning fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) til SMTHS. Denne forskningen ble også støttet av et fellesskap gitt til RJPK (nr. 37938) av CONACyT og Sistema Nacional de Investigadores (4422). Forfatterne takker CIATEJ for bruk av installasjonene under skriving av dette manuskriptet. Spesiell takk er utvidet til Dr. Víctor Manuel González Mendoza for alle anbefalinger i molekylærbiologi delen og Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM for fasiliteter under filmingen av denne artikkelen.

1. koffein utvinning i cellen suspensjoner av C. arabica L.
<ol><li>Bruke C. arabica celle suspensjoner9. Vedlikehold av suspensjon av annenhver uke subkulturer i Murashige og Skoog medium ved pH 4.3 med konstant 100 rpm risting ved 25 ° C under kontinuerlig lys (8.3 W/m2).</li>
	<li>Høste celler under vakuum filtrering ved hjelp av 11 µm pore filterpapir og Buchner trakt.</li>
	<li>Registrere frisk vekten av det avhentet celler med en skala, pakk dem i aluminiums...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Vi presenterer her de optimale forholdene for å vurdere koffein innhold, CS aktivitet og transkripsjon nivåer i en i vitro plante vev kultur, for eksempel celle suspensjoner av C. arabica. Tidligere rapporter har bekreftet at opprettholde celler under lys bestråling og i nærvær av theobromine i kultur medium er passende parametere for å øke nivået av koffein, gjør det mulig å evaluere metodene koffein separasjon bruker omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (RP-HPLC). Foreløpig er det...

Koffein er en Sekundær metabolitt som er biosynthesized av planter av slekten Coffea1. Denne alkaloid tilhører methylxanthine familie, og regnes som kjemiske fabrikk forsvar fordi det kan fungere mot de negative effektene av patogener og planteetere2,3. I tillegg er denne metabolitten ansvarlig for egenskapene stimulerende kaffe drikke, som vanlig forbrukt verdensomspennende4,5. På grunn av sine egenskaper, er flere forskningsgrupper interessert i å studere biosyntetiske veien og katabolisme koffein6,7. Foreløpig tjene anlegget i vitro cellen/vev kulturer som et alternativ for å vurdere koffein akkumulering under ulike biotiske og abiotiske strategier8,9.
Koffein biosyntesen innebærer hydrolytisk utgivelsen av 7-methylxanthine fra den tilsvarende ribose nukleosid etterfulgt av bestilte N-methylations posisjoner 3 og 1. En bestemt S- adenosyl metionin (SAM)-avhengige N-methyltransferase (NMT) gir metylering i posisjon 7, mens theobromine syntase (TS) og CS er involvert i den 3 - og 1-methylations, henholdsvis produsere theobromine og koffein. Studiet av gener som koder distinkte NMTs har tillatt forstå mekanismen som regulerer koffein produksjon10,11. CS, som har Nmethyltransferase aktivitet, gir de to siste trinnene av biosyntetiske veien koffein11. I kaffe treet planter, har det vært vist at lys stråling kan øke CS aktivitet, som resulterer i en økning i koffein biosyntesen. Nylig viste vi at vedlikehold av cellen suspensjoner av C. arabica L. under lys bestråling er den optimale tilstanden for evaluering av virkningene som produserer abiotiske stress faktorer påvirker biosyntetiske veien koffein8. Informasjonen i disse studiene kan ha programmer i metabolske engineering og systemer biologi for å maksimere studiet av koffein biosyntetiske veien i slike in vitro -systemer.
Gitt fordelene ved å få en passende modell for studiet av koffein biosyntesen, optimalisert vi utvinning vilkårene for koffein på cellen suspensjoner av C. arabica L. Det var også mulig å utvikle en nyttig protokoll for å studere den enzymatiske aktiviteten samt metodologiske trinn for å vurdere nivået på genet transkripsjoner av Coffea koffein syntase 1 (CCS1) koding Dette enzymet. Her, rapportere vi en protokoll for å trekke ut og kvantifisere koffein i C. arabica celle suspensjoner av tynne lag kromatografi og densitometry (TLC-densitometry).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) er et purine alkaloid i populære drikker som kaffe og te. Denne Sekundær metabolitt er ansett som en kjemisk forsvar fordi det har antimikrobielle aktivitet og regnes som en naturlig insektmiddel. Koffein kan også produsere negative allelopathic effekter som hindrer vekst av rundt planter. I tillegg bruker mennesker over hele verden koffein for sin smertestillende og stimulerende. På grunn av interesse for den teknologiske anvendelser av koffein, har forskning på den biosyntetiske sti av dette sammensatte vokst. Disse studiene har primært fokusert på å forstå de biokjemiske og molekylære mekanismene som regulerer biosyntesen av koffein. In vitro vev kultur har blitt et nyttig system for å studere denne biosyntetiske veien. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for kvantifisering av koffein og måle transkripsjon nivået av genet (CCS1) koding koffein syntase (CS) i celle suspensjoner C. arabica L. samt sin virksomhet.

Koffein utdrag Hentet via prosessen presenteres her ble analysert av TLC-densitometry ved å utsette prøvene til platen Ture i henhold til ordningen som vist i figur 1. Å kvantifisere nivåer av koffein i cellen ekstrakter, en kurve med ulike konsentrasjoner av kommersielle standard for denne forbindelsen ble brukt (figur 2A). Mønsteret av absorbansen for koffein var analysert i det synlige lyse spekteret (UV-VIS) med en maksi...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for utvinning og kvantifisering av koffein i cellen suspensjoner av C. arabica L. og en eksperimentell prosess for evaluering av den enzymatiske aktiviteten av koffein syntase med hvilket uttrykk genet som kodes dette enzymet.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen analytisk kjemi, biokjemi og bioteknologifelt. Slik som, hva er endringene som oppstår i koffein biosyntese. Den største fordelen med denne teknikken, er at den kan brukes på invitro plantemodeller som produserer koffein.Til å begynne med legger du til 10 milliliter aceton til de lyofiliserte cellene, og forsegler kolben før du blander med vortexmikseren i 30 sekunder. Bland deretter prøven ved 100 o/min med en rotator i fem timer ved romtemperatur. Etter dette, re-suspendere prøven med 25 mikroliter aceton.Først påfør en mikroliter av det tidligere tilberedte koffeinekstraktet til silikagelplatene. Deretter utvikler du TLC i kromatografikammeret med 10 milliliter i mobilfasen, cyklohexane aceton. Visualiser koffeinbåndene i kort bølgelengde ultrafiolett, med en kompakt UV-lampe.Etter dette kvantifiserer koffeinnivåer med densitometri ved 273 nanometer. Ved hjelp av filterpapir, støvsug den tidligere forberedt celle suspensjon. Deretter bruker du en porselensmørtel til å macerate celleprøven, med flytende nitrogen og RNA isolasjonsreagens, til den er homogenisert.Deretter overfører du 500 mikroliter av prøven til et sterilt mikrosentrigerrør. Deretter legger du til 300 mikroliter kloroform isoamylalkohol og 300 mikroliter av likevektsfenol. Bland prøven med en vortex mikser og sentrifuge den på 20,000G i 15 minutter ved fire grader Celsius.Etter dette overfører du 300 mikroliter i den øvre fasen til et rent mikrosentrigerrør. Deretter legger du til 200 mikroliter isopropanol og inkuberer røret i en time ved negative 20 grader Celsius. Tilsett en milliliter etanol til pelleten.Deretter sentrifuger røret ved 12, 000G i 10 minutter og dekanter væskefasen. Tørk deretter prøven i 1,5 timer ved romtemperatur. Deretter, re-suspendere RNA ekstrakt med 25 mikroliter dePC-behandlet vann.Først legger du til to mikrogram totalt RNA-ekstrakt til et sterilt mikrosentrigerrør. Deretter legger du til en mikroliter på 10X reaksjonsbuffer og en mikroliter DNase. Ta det endelige volumet av reaksjonen til 10 mikroliter med DEPC-behandlet vann.Deretter blander du prøven og sentrifugen på 2000G i ett minutt. Deretter inkuberer prøven ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette, tilsett en mikroliter på 50 mikromolardinatrium etylendiamine tetraacetat, for å stoppe reaksjonen.Inkuber prøven ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Deretter påfør deretter 100 nanogram RNA på en agarose gel og kjør gelen. Visualiser integriteten til RNA ved hjelp av et gelfotodokumentasjonssystem.Først legger du til 2,5 mikrogram totalt RNA til et mikrosentrigerrør. Deretter legger du til en mikroliter oligo deoksytymidon primer og fyller røret til et endelig volum på 13 mikroliter med kjernefritt vann. Bland prøven og sentrifuge den på 2, 000G i ett minutt.Inkuber prøven ved 65 grader Celsius i fem minutter. Og så på fire grader Celsius i to minutter. Deretter legger du til fire mikroliter med 5X reaksjonsbuffer, to mikroliter dNTP-blanding og en mikroliter omvendt transkripsjon til prøven.Bland deretter prøven forsiktig og sentrifuge ved 2, 000G i ett minutt. Etter dette inkuber prøven ved 45 grader Celsius i 50 minutter, og deretter ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Tilsett 7,5 mikroliter med 2X Taq DNA polymerase og 0,1 mikromol RAX, til et PCR mikro sentrifugerør.Deretter legger du til 0,75 mikroliter hver av fremover og omvendt primer for å forsterke CCS1 genet. Etter dette legger du til 600 nanogram CDNA-mal. Forhåndsform forsterkningsreaksjonen i sanntid PCR som beskrevet i tekstprotokollen.Deretter analyserer du dataene med PCR-programvaren. Vei ut ett gram cellulært materiale og pakk det i aluminiumsfolie. Etter macerating prøven, overføre den til et hetteglass med glass og tilsett 2,5 milliliter ekstraksjon buffer.Deretter sentrifugere prøven på 20,000G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør 500 mikroliter aliquots til kryogene hetteglass. Med et spektrofotometer måler du proteinkonsentrasjonen av prøven ved 562 nanometer ved hjelp av en bicinchoninsyreanalyse, med storfe serisk albumin som standard.Først forbereder du reaksjonsblandingen i et mikrosentridrifugerør, i henhold til tekstprotokollen. Deretter øker du det totale volumet til 200 mikroliter med 100 millimolar tris HCL. Husk at det er viktig for din egen sikkerhet å følge riktige forholdsregler under fremstilling av reaksjonsblanding med radioaktivt materiale.Hold mikrosentridrifugrøret på is og tilsett et volum av den oppløselige fraksjonen, som inneholder syv til ni milligram protein. Deretter virvler blandingen og inkuberer ved 30 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette sentrifuger prøvene på 11,000G i fem minutter.Deretter gjenoppretter du forsiktig et volum på 900 mikroliter, og overfører prøvene til et scintillasjons hetteglass. Deretter fordamper kloroformen for å fullføre tørrhet i hetten ved romtemperatur. Tilsett fem milliliter scintillasjonsvæske til hetteglasset.Til slutt analyserer du radioaktiviteten som er innlemmet i koffein ved hjelp av en scintillasjonsteller. I denne protokollen ble mønsteret av absorbans for koffein analysert via TLC densitometry, gjennom det synlige lysspekteret, og lesing i maksimal absorpsjon ved 273 nanometer. Separasjonskurven av koffein på TLC-platen, viste en RF mellom 0,34 og 0,39.RNA avledet fra suspenderte celler viser klare separasjoner av 28s, 18s og 5s RRNA underenheter, noe som indikerer at prøvene var av høy kvalitet. Til slutt ble en smeltekurve hentet fra QPCR-analysen, som viser et enkelt forsterkningsprodukt for koffeinsyntasegenet. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen bioteknologi og biokjemi for å utforske sekundær metaboliserende vevskultur fra kaffe, te og kokos.Ikke glem at arbeid med radioaktivitet og molekylær patologi kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som bruk av hansker, vernebriller og spesialutstyr for radioaktivt materiale skal alltid tas når du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Endre Baculovirus uttrykk vektorer å produsere utskilles anlegget proteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

En fargemetrisk analysen av citrate syntase aktivitet i Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En tilpasningsvennlig tilnærming for enzymatisk produksjon og rensing av Diterpenoid naturlige produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Skaffe transkripsjonsdata av høy kvalitet fra kornfrø med en modifisert metode for genuttrykksprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Ekstraksjon og kvantifisering av løselige, radiomerkede inositolpolyfosfater fra forskjellige plantearter ved hjelp av SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...