Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

O trabalho do nosso laboratório foi financiado por uma concessão do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) para SMTHS. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa de estudos concedida a RJPK (n. º 37938) pelo CONACyT e o Sistema Nacional de Investigadores (4422). Os autores graças a CIATEJ para a utilização das suas instalações durante a escrita deste manuscrito. Agradecimentos especiais são estendidos ao Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas as recomendações na seção de biologia molecular e Valentín Rodríguez de Mendoza, IFC, UNAM para as instalações durante as filmagens deste artigo.

1. cafeína extração em suspensões celulares de c. arabica L.
<ol><li>Use o c. arabica célula suspensões9. Manter as suspensões por subculturas quinzenais em meio de Murashige e Skoog em pH 4.3 com constante 100 rpm agitando a 25 ° C, sob luz contínua (8,3 W/m2).</li>
	<li>Colha as células sob vácuo filtração utilizando papel de filtro 11 µm poro e um funil de Buchner.</li>
	<li>Registrar o peso fresco das células coletadas usando uma escala, embrulhe e...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Apresentamos aqui as condições ideais para avaliar a conteúdo de cafeína, os níveis de atividade e transcrição de CS em um em vitro planta cultura de tecidos, tais como suspensões celulares de c. arabica. Relatórios anteriores confirmaram que mantém as células sob irradiação de luz e na presença de teobromina em meio de cultura são parâmetros adequados para aumentar o nível de cafeína, tornando possível a avaliação dos métodos de separação de cafeína usando a cromatografia líqu...

A cafeína é um metabólito secundário que é biossintetizados por plantas do gênero Coffea1. Este alcaloide pertence à família de methylxanthine e é considerado como uma defesa da planta química, porque ele pode agir contra os efeitos nocivos de patógenos e herbívoros de2,3. Além disso, este metabólito é responsável para as propriedades estimulantes da bebida café, que é comumente consumida em todo o mundo4,5. Devido a suas propriedades, diversos grupos de pesquisa estão interessados em estudar o caminho biossintético e catabolismo de cafeína6,7. Atualmente, a planta em vitro culturas de célula/tecido servem como uma alternativa para avaliar acúmulo de cafeína sob várias estratégias bióticos e abióticos8,9.
Biossíntese de cafeína envolve a liberação hidrolítica de 7-methylxanthine do correspondente nucleosídeo ribose seguido por ordenada de N-methylations nas posições 3 e 1. Um específico S- adenosilmetionina (SAM)-N-metiltransferase dependente (NMT) catalisa a metilação na posição 7, Considerando que a teobromina sintase (TS) e CS estão envolvidos na 3 - e 1-methylations, respectivamente, produzindo teobromina e cafeína. O estudo dos genes que codificam NMTs distintas permitiu compreender o mecanismo que regula a produção de cafeína10,11. CS, que tem N -metiltransferase atividade, catalisa as duas últimas etapas da via biossintética de cafeína11. Em mudas de árvores de café, ficou demonstrado que a radiação luminosa pode aumentar atividade CS, o que resulta em um aumento na biossíntese de cafeína. Recentemente, nós mostramos que a manutenção das suspensões celulares de c. arabica L. sob irradiação de luz é a condição ideal para avaliar os efeitos que produzem fatores de estresse abiótico que impactam o caminho biossintético de cafeína8. As informações obtidas nesses estudos podem ter aplicações em biologia de sistemas e engenharia metabólica para maximizar o estudo da via biossintética de cafeína em tais sistemas em vitro .
Dadas as vantagens de se obter um modelo adequado para o estudo da biossíntese de cafeína, nós aperfeiçoamos as condições de extração de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. Também foi possível desenvolver um protocolo útil para estudar a atividade enzimática, bem como os passos metodológicos para avaliação do nível de transcritos do gene de Coffea cafeína sintase 1 (CCS1) codificação desta enzima. Neste documento, nós relatamos um protocolo para extrair e quantificar a cafeína em suspensões celulares de c. arabica por cromatografia em camada delgada e densitometria (TLC-densitometria).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

(1,3,7-trimethylxanthine) a cafeína é um alcaloide de Purina, presente em bebidas populares como café e chá. Este metabolito secundário é considerado como uma defesa química, porque tem atividade antimicrobiana e é considerado um inseticida natural. Cafeína também pode produzir efeitos alelopático negativos que impedem o crescimento das plantas circunvizinhas. Além disso, as pessoas ao redor do mundo consomem cafeína para seus efeitos analgésicos e estimulante. Devido ao interesse nas aplicações tecnológicas da cafeína, pesquisa sobre o caminho biossintético deste composto tem crescido. Estes estudos centraram-se principalmente na compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares que regulam a biossíntese de cafeína. Cultura de tecidos in vitro tornou-se um sistema útil para estudar este caminho biossintético. Este artigo irá descrever um protocolo passo a passo para a quantificação de cafeína e para medir os níveis de transcrição do gene (CCS1) codificação cafeína sintase (CS) em suspensões celulares de c. arabica L., bem como a sua actividade.

Extratos de cafeína, obtidos através do processo aqui apresentado foram analisados por TLC-densitometria sujeitando as amostras para a placa de cromatografia de acordo com o esquema mostrado na Figura 1. Para quantificar os níveis de cafeína em extratos de células, uma curva com diferentes concentrações de padrão comercial para este composto foi usado (Figura 2A). O padrão de absorvância para cafeína foi analisado no e...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Este protocolo descreve uma metodologia eficiente para a extração e quantificação de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. e um processo experimental para avaliar a atividade enzimática da cafeína sintase com o nível de expressão de o gene que codifica esta enzima.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Este método pode ajudar a responder questões-chave nos campos de química analítica, bioquímica e biotecnologia. Tais como, quais são as mudanças que ocorrem na biossíntese da cafeína. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode ser aplicada a modelos de plantas invitro que produzem cafeína.Para começar, adicione 10 mililitros de acetona às células liofilizadas e sele o frasco antes de misturar com o misturador de vórtice por 30 segundos. Em seguida, misture a amostra a 100 rpm com um rotador por cinco horas em temperatura ambiente. Depois disso, suspenda a amostra com 25 microliters de acetona.Primeiro, aplique um microliter do extrato de cafeína previamente preparado nas placas de gel de sílica. Em seguida, desenvolva o TLC na câmara de cromatografia com 10 mililitros da fase móvel, acetona ciclohexana. Visualize as faixas de cafeína em ultravioleta de comprimento de onda curto, com uma lâmpada UV compacta.Depois disso, quantifique os níveis de cafeína por densitometria a 273 nanômetros. Utilizando papel filtro, filtro de vácuo a suspensão celular previamente preparada. Em seguida, use uma argamassa de porcelana para macerar a amostra celular, com nitrogênio líquido e reagente de isolamento de RNA, até que seja homogeneizada.Em seguida, transfira 500 microliters da amostra para um tubo micro centrífuga estéril. Em seguida, adicione 300 microliters de álcool clorofórmio isoamyl, e 300 microliters de fenol equilibrado. Misture a amostra com um misturador de vórtice e centrífuga a 20.000G por 15 minutos a quatro graus Celsius.Depois disso, transfira 300 microliters da fase superior para um tubo de micro centrífuga limpa. Em seguida, adicione 200 microliters de isopropanol e incubar o tubo por uma hora a 20 graus negativos Celsius. Adicione um mililitro de etanol à pelota.Em seguida, centrifugar o tubo a 12.000G por 10 minutos e decantar a fase líquida. Em seguida, seque a amostra por 1,5 horas em temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente o extrato de RNA com 25 microliters de água tratada com DEPC.Primeiro, adicione dois microgramas de extrato total de RNA a um tubo de micro centrífuga estéril. Em seguida, adicione um microliter de tampão de reação 10X e um microliter de DNase. Leve o volume final da reação para 10 microliters com água tratada com DEPC.Em seguida, misture a amostra e a centrífuga a 2.000G por um minuto. Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, adicione um microliter de 50 micromolar disodium etileno diamina tetraacetato, para parar a reação.Incubar a amostra a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique 100 nanogramas de RNA em um gel de agarose e execute o gel. Visualize a integridade do RNA usando um sistema de documentação de fotos em gel.Primeiro, adicione 2,5 microgramas de RNA total a um tubo de micro centrífuga. Em seguida, adicione um microliter de primer deoximidina oligo e encha o tubo a um volume final de 13 microliters com água sem nuclease. Misture a amostra e centrífuga a 2.000G por um minuto.Incubar a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos. E então a 4 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microliters de tampão de reação 5X, dois microliters de mix dNTP e um microliter de transcriptase reversa à amostra.Em seguida, misture a amostra suavemente e centrífuga a 2.000G por um minuto. Depois disso, incubar a amostra a 45 graus Celsius por 50 minutos e, em seguida, a 70 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 7,5 microliters de polimerase de DNA 2X Taq e 0,1 micromoles de RAX, a um tubo de micro centrífuga PCR.Em seguida, adicione 0,75 microliters cada um do primer dianteiro e reverso para amplificar o gene CCS1. Depois disso, adicione 600 nanogramas do modelo CDNA. Préforme a reação de amplificação em tempo real pcr como descrito no protocolo de texto.Em seguida, analise os dados com o software PCR. Pese um grama de material celular e embale-o em papel alumínio. Depois de macerar a amostra, transfira-a para um frasco de vidro e adicione 2,5 mililitros de tampão de extração.Em seguida, centrifugar a amostra a 20.000G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 500 alíquotas de microliters em frascos criogênicos. Com um espectrofotômetro, meça a concentração proteica da amostra em 562 nanômetros usando um ensaio de ácido bicinchonínico, com albumina bovina sênica como padrão.Primeiro, prepare a mistura de reação em um tubo de micro centrífuga, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, aumente o volume total para 200 microliters com 100 tris mililitros HCL. Lembre-se, é imprescindível para sua própria segurança seguir as precauções adequadas durante a preparação da mistura de reação com material radioativo.Mantenha o tubo de micro centrífuga no gelo e adicione um volume da fração solúvel, contendo de sete a nove miligramas de proteína. Em seguida, vórtice da mistura e incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, centrifufique as amostras a 11.000G por cinco minutos.Em seguida, recupere cuidadosamente um volume de 900 microliters, e transfira as amostras para um frasco de cintilação. Em seguida, evaporar o clorofórmio para completar o ressecamento no capô à temperatura ambiente. Adicione cinco mililitros de fluido de cintilação ao frasco.Por fim, analise a radioatividade incorporada à cafeína usando um contador de cintilação. Neste protocolo, o padrão de absorção de cafeína foi analisado via densitometria TLC, através do espectro de luz visível, e leitura em absorção máxima em 273 nanômetros. A curva de separação da cafeína na placa TLC, mostrou um RF entre 0,34 e 0,39.O RNA derivado de células suspensas exibe separações claras das subunidades RRNA 28s, 18s e 5s, indicando que as amostras eram de alta qualidade. Finalmente, uma curva de derretimento foi obtida a partir da análise QPCR, mostrando um único produto de amplificação para o gene de sinthase de cafeína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de biotecnologia e bioquímica explorarem a cultura secundária de tecidos metabolizadores a partir do café, chá e coco.Não se esqueça que trabalhar com radioatividade e patologia molecular pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas, óculos e equipamentos especiais para material radioativo devem ser sempre tomadas na realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Bioquímica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtenção de dados de transcriptome de alta qualidade de sementes de cereal por um método modificado para criação de perfil de expressão genética

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Extração e Quantificação de Polifosfatos inositol solúveis e radiolabelados de diferentes espécies vegetais usando SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...