Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Работа нашей лаборатории был профинансирован грант от Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ 219893) на SMTHS. Это исследование было также поддержано стипендий, предоставленных КОНАСИТ и Sistema Nacional de Investigadores (4422) к RJPK (№ 37938). Авторы благодарят CIATEJ за использование его объектов во время написания этой рукописи. Специальная благодарность д-р Виктор Мануэль Гонсалес Мендоса для всех рекомендаций, содержащихся в секции молекулярной биологии и Валентин Мендоса Родригес, МФК, ЮНАМ для удобства во время съемок этой статьи.

1. кофеин добыча в клеточных суспензий C. arabica л
<ol><li>Используйте суспензий клеток C. arabica 9. Поддерживать суспензий, раз в две недели субкультур в фотосинтетическую и Скуг средах при рН 4,3 с постоянной тряски при 25 ° C под непрерывный свет (8,3 Вт/м2) 100 об/мин.</li>
	<li>У...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Мы представляем оптимальные условия для оценки содержания кофеина, уровней активности и Стенограмма CS в в vitro растений культуры ткани, такие как клеточных суспензий C. arabica. Предыдущие доклады подтвердили, что поддержание клетки под легкие облучения и в присутствии теобромин в...

Кофеин является вторичные метаболиты, biosynthesized растениями рода Coffea1. Этот алкалоид принадлежит к семейству метилксантина и рассматривается как химический завод обороны, потому что он может выступать против неблагоприятных последствий патогенов и травоядных животных2,3. Кроме того этот метаболит отвечает за стимулирование свойств кофейный напиток, который обычно потребляются во всем мире4,5. Благодаря своим свойствам несколько исследовательских групп заинтересованы в изучении биосинтетических путь и катаболизма кофеин6,7. В настоящее время завод в пробирке клеток/тканей культур служат в качестве альтернативы для оценки накопления кофеин под различными биотическими и абиотическими стратегии8,9.
Кофеин биосинтез включает гидролитическая выпуск 7-метилксантина от соответствующего рибозы нуклеозидов, после чего приказал N-methylations в позициях 3 и 1. Конкретный S- аденозил-метионина (SAM)-зависимых N-метилтрансфераза (NMT) катализирует метилирования в позиции 7, тогда как теобромин синтаза (ТС) и CS участвуют в 3 - и 1-methylations, соответственно, производства теобромин и Кофеин. Изучение генов, кодирующих собственный NMTs позволяет понять механизм, который регулирует кофеин производства10,11. CS, который имеет N -метилтрансфераза активность, катализирует два последних шага биосинтетических путь кофеин11. В кофе сеянцев было показано, что излучения могут увеличить активность CS, что приводит к увеличению биосинтеза кофеин. Недавно мы показали, что поддержание суспензий клеток C. arabica л под легкие облучения является оптимальное состояние для оценки воздействия, которые производят абиотического стресса факторов, влияющих на биосинтетические путь кофеин8. Информация, полученная в рамках этих исследований могут иметь приложений в метаболических систем и техники биологии для максимального изучение кофеин биосинтетических путь в таких системах в пробирке .
Учитывая преимущества получения подходящую модель для изучения биосинтеза кофеин, мы оптимизировали условий извлечения кофеина на клеточных суспензий C. arabica л Также удалось разработать полезные протокол для изучения ферментативную активность, а также методологических шаги для оценки уровня транскриптов гена кофе кофеин синтетазы кодирования этого фермента 1 (CCS1). Здесь мы приводим протокол для извлечения и количественно кофеина в C. arabica клеточных суспензий тонкослойной хроматографии и денситометрии (TLC-денситометрия).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Кофеин (1,3,7-trimethylxanthine) является Пуриновые алкалоиды в популярных напитков, как кофе и чай. Это вторичные метаболиты рассматривается как химической обороны, потому что она обладает антимикробной активностью и считается природных инсектицидов. Кофеин может также производить отрицательный аллелопатические эффектов, которые предотвратить рост окружающих растений. Кроме того люди во всем мире потребляют кофеин для его болеутоляющим и стимулирующее воздействие. Из-за интереса в области технологического применения кофеина выросла исследований биосинтетических пути этого соединения. Эти исследования были главным образом сосредоточены на понимание биохимических и молекулярных механизмов, которые регулируют биосинтеза кофеина. В vitro тканевой культуры стала полезной системы для изучения этой биосинтетических путь. Этой статье будут описаны пошаговые протокол для количественного определения кофеина и для измерения уровней Транскрипт гена (CCS1) кодирования кофеин синтазы (CS) в клеточных суспензий C. arabica л, а также ее деятельности.

Кофеин экстракты, полученные через этот процесс, представленные здесь были проанализированы TLC-денситометрия, подвергая образцы для пластины хроматографии по схеме показано на рисунке 1. Для количественной оценки уровни кофеина в клеточных экстракто?...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Этот протокол описывает эффективная методология для извлечения и количественной оценки кофеина в клеточных суспензий л. C. arabica и экспериментальный процесс оценки Ферментативная активность кофеин синтазы с уровнем экспрессии ген, который кодирует этого фермента.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аналитической химии, биохимии и биотехнологии. Такие, как, какие изменения происходят в биосинтезе кофеина. Основным преимуществом этой техники является то, что она может быть применена к моделям растений invitro, которые производят кофеин.Для начала добавьте 10 миллилитров ацетона в лиофилизированные клетки и запечатайте колбу перед смешиванием с миксером вихря в течение 30 секунд. Затем смешайте образец при 100 об/мин с ротатором в течение пяти часов при комнатной температуре. После этого повторно приостанавливаем образец с 25 микролитров ацетона.Во-первых, нанесите один микролитер ранее подготовленного экстракта кофеина на пластины кремнеземного геля. Затем разработайте TLC в хроматографической камере с 10 миллилитров мобильной фазы, циклохексан ацетон. Визуализуйте полосы кофеина в коротковолновом ультрафиолетовом диапазоне с компактной УФ-лампой.После этого количественно уровень кофеина по денситометрии составляет 273 нанометров. Используя фильтровальную бумагу, вакуумный фильтр предварительно подготовленную подвеску ячейки. Затем используйте фарфоровый раствор для мацератации образца клетки с жидким азотом и реагентом изоляции РНК, пока он не будет гомогенизирован.Затем перенесите 500 микролитров образца в стерильную микро центрифугу. Затем добавьте 300 микролитров хлороформного изоамилового спирта и 300 микролитров равноотрещенного фенола. Смешайте образец с вихревой смеситель и центрифуга его на 20000G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.После этого перенесите 300 микролитров верхней фазы в чистую микро центрифугу. Затем добавьте 200 микролитров изопропанола и инкубировать трубку в течение одного часа при отрицательном 20 градусов по Цельсию. Добавьте в гранулы один миллилитр этанола.Затем центрифуга трубки при 12 000 Г в течение 10 минут и декантировать жидкую фазу. Затем высушите образец в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Затем повторно приостанавливаем экстракт РНК с 25 микролитров воды, обработанной DEPC.Во-первых, добавьте два микрограмма общего экстракта РНК в стерильную микро центрифугу. Затем добавьте один микролитер буфера реакции 10X и один микролитер DNase. Довнесите окончательный объем реакции до 10 микролитров с помощью воды, обработанной DEPC.Затем смешайте образец и центрифугу при 2000 Г в течение одной минуты. Затем инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого добавьте один микролитр из 50 микромолярной этилен диамин тетраацетат, чтобы остановить реакцию.Инкубировать образец при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Затем нанесите 100 нанограмм РНК на гель агарозы и запустите гель. Визуализуйте целостность РНК с помощью системы фотодокументарной документации геля.Во-первых, добавьте 2,5 микрограмма общей РНК в микро центрифугу трубки. Затем добавьте один микролитр олиго деокситимидин грунтовки и заполните трубку до конечного объема 13 микролитров с нуклеазной водой. Смешайте образец и центрифуга его на 2000G в течение одной минуты.Инкубировать образец при 65 градусах по Цельсию в течение пяти минут. А потом при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут. Затем добавьте в образец четыре микролитера буфера реакции 5X, два микролитров смеси dNTP и один микролитер обратной транскриптазы.Затем аккуратно смешайте образец и центрифугу при 2 000 г в течение одной минуты. После этого инкубировать образец при 45 градусах по Цельсию в течение 50 минут, а затем при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Добавьте 7,5 микролитров полимеразы ДНК 2X Taq и 0,1 микромолета RAX в микро центрифугу ПЦР.Затем добавьте 0,75 микролитров каждый из вперед и обратной грунтовки, чтобы усилить ген CCS1. После этого добавьте 600 нанограммов шаблона CDNA. Предварительноформировать реакцию усиления в ПЦР в режиме реального времени, как описано в текстовом протоколе.Затем проанализируйте данные с помощью программного обеспечения PCR. Взвесь один грамм клеточного материала и упаковать его в алюминиевую фольгу. После мацерации образца перенесите его в стеклянный флакон и добавьте 2,5 миллилитров буфера извлечения.Далее, центрифуга образца на 20000G в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите 500 микролитров алицитов в криогенные флаконы. С помощью спектрофотометра, измерить концентрацию белка образца на 562 нанометров с помощью анализа бицинхониновой кислоты, с бычьим серическим альбумином в качестве стандарта.Во-первых, подготовить реакционной смеси в микро центрифуге трубки, в соответствии с текстовым протоколом. Затем увеличьте общий объем до 200 микролитров со 100 миллимолярной тройкой HCL. Помните, что для вашей собственной безопасности необходимо соблюдать надлежащие меры предосторожности при подготовке реакционной смеси с радиоактивным материалом.Держите трубку микро центрифуги на льду и добавьте объем растворимой фракции, содержащей от семи до девяти миллиграммов белка. Затем вихрь смеси и инкубировать при 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После этого центрифугировать образцы на 11 000G в течение пяти минут.Затем тщательно восстановите объем в 900 микролитров и перенесите образцы в сцинтилляционный флакон. Далее испаряется хлороформ для полной сухости в капюшоне при комнатной температуре. Добавьте пять миллилитров сцинтилляционной жидкости во флакон.Наконец, проанализировать радиоактивность включены в кофеин с помощью счетчика сцинтилляции. В этом протоколе, картина поглощения кофеина была проанализирована с помощью TLC денситометрии, через видимый спектр света, и чтение в максимальном поглощении на 273 нанометров. Кривая разделения кофеина на пластине TLC показала РФ между 0,34 и 0,39.РНК, полученная из подвесных клеток, демонстрирует четкое разделение подразделений 28-х, 18-х и 5-х РРНК, что свидетельствует о высоком качестве образцов. Наконец, кривая расплава была получена из анализа ПЦР, показывающего один продукт усиления гена синтазы кофеина. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биотехнологии и биохимии для изучения вторичной метаболизации культуры тканей из кофе, чая и кокоса.Не забывайте, что работа с радиоактивностью и молекулярной патологией может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда принимаются меры предосторожности, такие как использование перчаток, очков и специального оборудования для радиоактивного материала.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Экспрессия, очистка и антимикробная активность S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Изменение бакуловирусы векторы выражения производить выделяется растительных белков в клетках насекомых

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Настраиваемый подход к ферментативным производством и очистке терепенидов натуральных продуктов

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Извлечение и количественная оценка растворимых, радиозамазаемых поликомолокаторов инозитолов различных видов растений с использованием SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...