Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

El trabajo de nuestro laboratorio fue financiado por una subvención de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a Smiths. Esta investigación también fue apoyada por una beca otorgada a RJPK (núm. 37938) por CONACyT y el Sistema Nacional de Investigadores (4422). Los autores agradecen CIATEJ para el uso de sus instalaciones durante la escritura de este manuscrito. Especial agradecimiento se extiende a Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas las recomendaciones en la sección de biología molecular y Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM por las facilidades durante la filmación de este artículo.

1. la cafeína extracción en suspensiones celulares de C. arabica L.
<ol><li>Uso de suspensiones de células de C. arabica 9. Mantener las suspensiones quincenales subcultivos en un medio Murashige y Skoog a pH 4.3 con constante 100 rpm de agitación a 25 ° C bajo luz continua (8,3 W/m2).</li>
	<li>Cosecha de las células debajo de filtración de vacío utilizando papel de filtro de poro de 11 μm y un embudo de Buchner.</li>
	<li>Registrar el peso fresco de las c?...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Aquí presentamos las condiciones óptimas para evaluar el contenido de cafeína, niveles de actividad y transcripción de CS en una en vitro planta de cultivo de tejidos, tales como suspensiones celulares de C. arabica. Informes anteriores han confirmado que las células manteniendo bajo irradiación de la luz y en presencia de teobromina en el medio de cultivo son los parámetros adecuados para incrementar el nivel de cafeína, lo que es posible evaluar los métodos de separación de la cafeína utili...

La cafeína es un metabolito secundario que es biosynthesized por plantas del género Coffea1. Este alcaloide pertenece a la familia de metilxantinas y es considerada como una defensa química de la planta porque puede actuar contra los efectos adversos de agentes patógenos y herbívoros2,3. Además, este metabolito es responsable de las propiedades estimulantes de la bebida de café, que es consumido en todo el mundo4,5. Debido a sus propiedades, diversos grupos de investigación están interesados en el estudio de la vía biosintética y catabolismo de cafeína6,7. Actualmente, cultivos de vegetales en vitro de la célula y tejidos sirven como una alternativa para evaluar la acumulación de cafeína en diferentes estrategias bióticos y abióticos8,9.
Biosíntesis de la cafeína implica la liberación hidrolítica de 7-metilxantina de la nucleósido ribosa correspondiente seguido de orden N-metilaciones en las posiciones 3 y 1. Una específico S- adenosil metionina (SAM)-dependiente N-metiltransferasa (NMT) cataliza la metilación en la posición 7, considerando que la teobromina sintasa (TS) y CS están implicados en las metilaciones 3 y 1, respectivamente, produciendo teobromina y cafeína. El estudio de genes que codifican distintos territorios no metropolitanos ha permitido entender el mecanismo que regula la producción de cafeína10,11. CS, que tiene N -methyltransferase actividad, cataliza los dos últimos pasos de la vía biosintética del cafeína11. En plántulas de cafeto, se ha demostrado que la radiación de la luz puede aumentar actividad de la CS, que se traduce en un aumento en la biosíntesis de la cafeína. Recientemente, demostró que el mantenimiento de suspensiones celulares de C. arabica L. bajo irradiación de la luz es la condición óptima para la evaluación de los efectos que producen los factores de estrés abióticos que afectan la vía biosintética del cafeína8. La información obtenida en estos estudios puede tener aplicaciones en la biología ingeniería y sistemas metabólica para maximizar el estudio de la vía biosintética de la cafeína en estos sistemas in vitro .
Dadas las ventajas de obtener un modelo adecuado para el estudio de la biosíntesis de la cafeína, hemos optimizado las condiciones de extracción de la cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. También fue posible desarrollar un protocolo útil para el estudio de la actividad enzimática así como los pasos metodológicos para evaluar el nivel de las transcripciones del gene del synthase del cafeína de Coffea 1 (ECC1) codificación de esta enzima. Adjunto, Divulgamos un protocolo para extraer y cuantificar cafeína en suspensiones celulares de C. Arábica por cromatografía en capa fina y densitometría (TLC-densitometría).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un alcaloide de purinas presente en bebidas populares como el café y té. Este metabolito secundario es considerado como una defensa química ya que tiene actividad antimicrobiana y es considerado un insecticida natural. La cafeína también puede producir efectos negativos alelopáticos que impiden el crecimiento de las plantas circundantes. Además, personas de todo el mundo consuman cafeína por sus efectos analgésicos y estimulantes. Debido al interés en las aplicaciones tecnológicas de la cafeína, ha crecido la investigación sobre la vía biosintética de este compuesto. Estos estudios se han centrado principalmente en la comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la biosíntesis de la cafeína. Cultivo de tejidos in vitro se ha convertido en un sistema útil para el estudio de este camino biosintético. Este artículo describe un protocolo paso a paso para la cuantificación de cafeína y de medición de los niveles de transcripción del gen (ECC1) codificación cafeína sintasa (CS) en suspensiones celulares de C. arabica L., así como su actividad.

Extractos de cafeína obtenidos mediante el proceso aquí presentado fueron analizados por TLC-densitometría sometiendo las muestras para la placa de cromatografía de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 1. Para cuantificar los niveles de cafeína en los extractos de la célula, una curva con diferentes concentraciones del estándar comercial para este compuesto fue utilizado (figura 2A). Se analizó el patrón de absor...

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Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas

Este protocolo describe una metodología eficiente para la extracción y cuantificación de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y un proceso experimental para la evaluación de la actividad enzimática de la cafeína sintasa con el nivel de expresión de el gen que codifica esta enzima.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química analítica, la bioquímica y la biotecnología. Por ejemplo, ¿cuáles son los cambios que se producen en la biosíntesis de cafeína. La principal ventaja de esta técnica, es que se puede aplicar a modelos de plantas invitro que produce cafeína.Para comenzar, agregue 10 mililitros de acetona a las células liofilizadas, y selle el matraz antes de mezclarlo con el mezclador de vórtice durante 30 segundos. A continuación, mezcle la muestra a 100 rpm con un rotador durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de esto, vuelva a suspender la muestra con 25 microlitros de acetona.En primer lugar, aplicar un microlitro del extracto de cafeína previamente preparado en las placas de gel de sílice. A continuación, desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mililitros de la fase móvil, acetona de ciclohexano. Visualice las bandas de cafeína en longitud de onda corta ultravioleta, con una lámpara UV compacta.Después de esto, cuantificar los niveles de cafeína por densitometría a 273 nanómetros. Con papel de filtro, filtre al vacío la suspensión celular previamente preparada. A continuación, utilice un mortero de porcelana para macerar la muestra celular, con nitrógeno líquido y reactivo de aislamiento de ARN, hasta que se homogeneice.A continuación, transfiera 500 microlitros de la muestra a un tubo estéril de micro centrífuga. A continuación, agregue 300 microlitros de alcohol isoamilo cloroformo y 300 microlitros de fenol equilibrado. Mezcle la muestra con un mezclador de vórtice y centrifugarlo a 20.000G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Después de esto, transfiera 300 microlitros de la fase superior a un tubo de micro centrífuga limpia. Luego, agregue 200 microlitros de isopropanol e incubar el tubo durante una hora a 20 grados Celsius negativos. Añadir un mililitro de etanol al pellet.A continuación, centrifugar el tubo a 12.000G durante 10 minutos y decantar la fase líquida. A continuación, seque la muestra durante 1,5 horas a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el extracto de ARN con 25 microlitros de agua tratada con DEPC.En primer lugar, añadir dos microgramos de extracto total de ARN a un tubo de micro centrífuga estéril. A continuación, agregue un microlitrotro de búfer de reacción 10X y un microlitro de DNase. Lleve el volumen final de la reacción a 10 microlitros con agua tratada con DEPC.A continuación, mezcle la muestra y la centrífuga a 2.000G durante un minuto. A continuación, incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, añadir un microlitro de 50 micromolar disódico etileno diamina tetraacetato, para detener la reacción.Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aplicar 100 nanogramos de ARN a un gel de agarosa y ejecutar el gel. Visualice la integridad del ARN utilizando un sistema de documentación fotográfica de gel.En primer lugar, añadir 2,5 microgramos de ARN total a un tubo de micro centrífuga. A continuación, agregue un microlitros de la imprimación de desoximidina de oligo y llene el tubo a un volumen final de 13 microlitros con agua libre de nucleasas. Mezcle la muestra y centríféquela a 2.000G durante un minuto.Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Y luego a cuatro grados centígrados durante dos minutos. A continuación, añada cuatro microlitros de búfer de reacción 5X, dos microlitros de mezcla dNTP y un microlitr de transcriptasa inversa a la muestra.A continuación, mezcle la muestra suavemente y centrifugar a 2.000G durante un minuto. Después de esto, incuba la muestra a 45 grados centígrados durante 50 minutos, y luego a 70 grados celsius durante 10 minutos. Añadir 7,5 microlitros de 2X Taq DNA polimerasa y 0,1 micromoles de RAX, a un tubo de micro centrífuga PCR.A continuación, agregue 0,75 microlitros cada uno de imprimación hacia adelante y hacia atrás para amplificar el gen CCS1. Después de esto, agregue 600 nanogramos de plantilla CDNA. Preformar la reacción de amplificación en tiempo real PCR como se describe en el protocolo de texto.Entonces, analice los datos con el software PCR. Pesar un gramo de material celular y empacarlo en papel de aluminio. Después de macerar la muestra, transfiétela a un vial de vidrio y agregue 2,5 mililitros de tampón de extracción.A continuación, centrifugar la muestra a 20.000G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 500 microlitros alícuotas alícuotas en viales criogénicos. Con un espectrofotómetro, mida la concentración proteica de la muestra a 562 nanómetros utilizando un ensayo de ácido bicinchoninic, con la albúmina serica bovina como estándar.En primer lugar, preparar la mezcla de reacción en un tubo de micro centrífuga, de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, aumente el volumen total a 200 microlitros con 100 tris milimétricos HCL. Recuerde, es imperativo que su propia seguridad siga las precauciones adecuadas durante la preparación de la mezcla de reacción con material radiactivo.Mantenga el tubo de micro centrífuga sobre hielo y agregue un volumen de la fracción soluble, que contenga de siete a nueve miligramos de proteína. Luego, vórtice la mezcla e incubar a 30 grados Centígrados durante 30 minutos. Después de esto, centrifugar las muestras a 11.000G durante cinco minutos.A continuación, recupere cuidadosamente un volumen de 900 microlitros y transfiera las muestras a un vial de centelleo. A continuación, evapore el cloroformo para completar la sequedad en la campana a temperatura ambiente. Añadir cinco mililitros de líquido de centelleo al vial.Finalmente, analizar la radiactividad incorporada en la cafeína utilizando un contador de centelleo. En este protocolo, el patrón de absorbancia para la cafeína se analizó a través de la densitometría TLC, a través del espectro de luz visible, y la lectura en máxima absorción a 273 nanómetros. La curva de separación de cafeína en la placa TLC, mostró una RF entre 0.34, y 0.39.El ARN derivado de células suspendidas exhibe separaciones claras de las subunidades de ARNr 28, 18s y 5s, lo que indica que las muestras eran de alta calidad. Finalmente, se obtuvo una curva de fusión del análisis QPCR, mostrando un único producto de amplificación para el gen de la cafeína sintasa. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biotecnología y la bioquímica exploraran el cultivo secundario de tejido metabolizante a partir del café, el té y el coco.No olvide que trabajar con radiactividad y patología molecular puede ser extremadamente peligroso, y siempre se tomarán precauciones como el uso de guantes, gafas y equipos especiales para material radiactivo al realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Investigación

Bioquímica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modificación de vectores de expresión de Baculovirus para producir secretado proteínas vegetales en células de los insectos

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

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Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Un enfoque personalizable para la producción enzimática y la purificación de productos naturales diterpenoides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtención de datos de transcriptoma de alta calidad de Cereal Seeds mediante un método modificado para la generación de perfiles de expresión génica

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Extracción y cuantificación de polifosfatos de inositol solubles y radiomarcados de diferentes especies vegetales utilizando SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...