Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Arbetet i vårt laboratorium finansierades genom ett bidrag från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) till SMTHS. Denna forskning stöddes också av ett stipendium till RJPK (No. 37938) beviljat CONACyT och de Sistema Nacional de Investigadores (4422). Författarna tackar CIATEJ för användning av dess installationer under skrivandet av detta manuskript. Speciellt tack utvidgas till Dr Víctor Manuel González Mendoza för alla rekommendationer i molekylärbiologi avsnitt och Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM för anläggningar under inspelningen av denna artikel.

1. koffein utvinning i cellsuspensioner av C. arabica L.
<ol><li>Använda C. arabica cell suspensioner9. Upprätthålla upphävanden av varannan vecka subkulturer i Murashige och Skoog medium vid pH 4.3 med konstant 100 rpm skakar vid 25 ° C under kontinuerlig ljus (8,3 W/m2).</li>
	<li>Skörda cellerna under dammsugarfilter använder 11 µm porstorlek filterpapper och en Buchner tratt.</li>
	<li>Registrera den färska vikten av insamlade celler med hjälp av en ska...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Vi presenterar här de optimala förutsättningarna för att utvärdera koffeinhalt, CS aktivitet och avskrift nivåer i en in vitro- växt vävnaden kultur, såsom cellsuspensioner av C. arabica. Tidigare rapporter har bekräftat att upprätthålla celler under ljus bestrålning och i närvaro av teobromin i odlingssubstratet är lämpliga parametrar för att öka nivån av koffein, vilket gör det möjligt att utvärdera de koffein separationsmetoder använda omvänd fas högpresterande vätskekromato...

Koffein är en sekundär metabolit som är biosyntetiseras av växter av släktet Coffea1. Denna alkaloid tillhör familjen methylxanthine och betraktas som en kemisk fabrik försvar eftersom det kan agera mot de negativa effekterna av patogener och växtätare2,3. Denna metabolit är dessutom ansvarig för kaffedrycken, som är allmänt konsumeras i världen4,5stimulerande egenskaper. På grund av dess egenskaper, är flera forskargrupper intresserade studera biosyntetisk väg och katabolism av koffein6,7. För närvarande, fungera växt i vitro cell/vävnadskulturer som ett alternativ för att utvärdera koffein ackumulering under olika biotiska och abiotiska strategier8,9.
Koffein biosyntes lansering hydrolytiska av 7-methylxanthine från den motsvarande ribos nukleosid följt av beställda N-methylations i position 3 och 1. En specifik S- adenosyl metionin (SAM)-beroende N-metyltransferas (NMT) katalyserar metyleringen vid position 7, medan teobromin synthase (TS) och CS är inblandade i den 3 - och 1-methylations, respektive, producerar teobromin och koffein. Studier av gener som kodar för distinkta NMTs låtit förstå den mekanism som reglerar koffein produktion10,11. CS, som har N -metyltransferas aktivitet, katalyserar de sista två stegen av biosyntetisk väg av koffein11. I kaffe plantor, har det visat att ljus strålning kan öka CS aktivitet, vilket resulterar i en ökning av koffein biosyntes. Vi visade nyligen att underhållet av cellsuspensioner C. arabica l. under ljus bestrålning är den optimala villkoren för att utvärdera de effekter som producerar abiotisk stressfaktorer som påverkar den biosyntetiska vägen av koffein8. Den information som erhålls i dessa studier kan ha program i metabola engineering och systembiologi för att maximera studien av koffein biosyntetisk väg i sådana in vitro- system.
Med tanke på fördelarna med att erhålla en lämplig modell för studier av koffein biosyntes, optimerat vi utvinning villkoren för koffein på cellsuspensioner C. arabica L. Det var också möjligt att utveckla ett användbart protokoll för att studera den enzymatiska aktivitet samt metodologiska steg för bedömningen av genen utskrifter av Coffea koffein syntas 1 (CCS1) kodning detta enzym. Häri, rapporterar vi ett protokoll att extrahera och kvantifiera koffein i C. arabica cellsuspensioner genom tunnskiktskromatografi och densitometry (TLC-densitometry).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) är en purin alkaloid i populära drycker som kaffe och te. Denna sekundära metabolit betraktas som kemiska försvar eftersom det har antimikrobiell aktivitet och anses vara ett naturligt insektsmedel. Koffein kan också producera negativa allelopathic effekter som förhindrar tillväxten av omgivande växter. Dessutom, konsumerar människor runt om i världen koffein för sina smärtstillande och stimulerande effekter. På grund av intresse för de tekniska tillämpningarna av koffein, har forskning om den biosyntetiska vägen för denna förening vuxit. Dessa studier har främst fokuserat på att förstå de biokemiska och molekylära mekanismer som reglerar biosyntesen av koffein. In vitro vävnadskultur har blivit ett användbart system för att studera denna biosyntetisk väg. Denna artikel kommer att beskriva en stegvisa protokoll för kvantifiering av koffein och för att mäta avskrift nivåerna av genen (CCS1) kodning koffein synthase (CS) i cellsuspensioner C. arabica L. samt dess aktivitet.

Koffein extrakt erhålls via processen presenteras här analyserades av TLC-densitometry genom att utsätta proverna till tallrik kromatografi enligt schemat visas i figur 1. Att kvantifiera mängden koffein i cell extrakt, en kurva med olika koncentrationer av kommersiell standard för denna förening var används (figur 2A). Mönstret av absorbansen för koffein analyserades i det synliga spektrat (UV-VIS) med en maximal absorp...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Det här protokollet beskriver en effektiv metod för utvinning och kvantifiering av koffein i cellsuspensioner C. arabica l. och en experimentell process för att utvärdera den enzymatiska aktiviteten av koffein syntas med uttryck den gen som kodar detta enzym.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom områdena analytisk kemi, biokemi och bioteknik. Såsom, vilka är de förändringar som sker i koffein biosyntesen. Den största fördelen med denna teknik, är att den kan tillämpas på invitro växtmodeller som producerar koffein.Till att börja med, tillsätt 10 milliliter aceton till lyophilized celler, och täta kolven innan blandning med vortex mixer i 30 sekunder. Blanda sedan provet i 100 varv/min med en rotator i fem timmar i rumstemperatur. Efter detta, åter avbryta provet med 25 mikroliter aceton.Applicera först en mikroliter av det tidigare beredda koffeinextraktet på kiselgelplattorna. Utveckla sedan TLC i kromatografikammaren med 10 milliliter av den mobila fasen, cyklohexan aceton. Visualisera koffeinbanden i kort våglängds ultraviolett, med en kompakt UV-lampa.Efter detta, kvantifiera koffeinnivåer av densitometri på 273 nanometer. Med hjälp av filterpapper, vakuumfilter den tidigare förberedda cellupphängningen. Använd sedan en porslinsbrukare för att macerate cellprovet, med flytande kväve och RNA-isoleringsreagens, tills det homogeniseras.Därefter överför du 500 mikroliter av provet till ett sterilt mikrocentrifugrör. Sedan, tillsätt 300 mikroliter av kloroform isoamyl alkohol, och 300 mikroliter av ekvilokol. Blanda provet med en virvelblandare och centrifugera det vid 20, 000G i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Efter detta överför du 300 mikroliter av den övre fasen till ett rent mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan 200 mikroliter isopropanol och inkubera röret i en timme vid negativa 20 grader Celsius. Tillsätt en milliliter etanol till pelleten.Sedan centrifug röret vid 12, 000G i 10 minuter och dekantera vätskefasen. Därefter torka provet i 1,5 timmar vid rumstemperatur. Därefter, åter upphäva RNA-extraktet med 25 mikroliter av DEPC-behandlat vatten.Lägg först till två mikrogram totalt RNA-extrakt till ett sterilt mikrocentrifugrör. Lägg sedan till en mikroliter av 10X reaktionsbuffert och en mikroliter DNase. Ta med den slutliga volymen av reaktionen på 10 mikroliter med DEPC-behandlat vatten.Blanda sedan provet och centrifugen vid 2, 000G i en minut. Därefter inkubera provet vid 37 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta, tillsätt en mikroliter av 50 mikromolarnanodium etendiamin tetraacetat, att stoppa reaktionen.Inkubera provet vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Applicera sedan 100 nanogram RNA på en agarosgel och kör gelen. Visualisera integriteten hos RNA med hjälp av ett gel fotodokumentationssystem.Lägg först till 2,5 mikrogram totalt RNA till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan en mikroliter oligo deoxythymidine primer och fyll röret till en slutlig volym av 13 mikroliter med nukleasfritt vatten. Blanda provet och centrifugera det på 2, 000G i en minut.Inkubera provet vid 65 grader Celsius i fem minuter. Och sen vid fyra grader Celsius i två minuter. Därefter lägger du till fyra mikroliter av 5X-reaktionsbuffert, två mikroliter av dNTP-mix och en mikroliter av omvänd transkriptas till provet.Blanda sedan provet försiktigt och centrifug vid 2, 000G i en minut. Efter detta, inkubera provet vid 45 grader Celsius i 50 minuter, och sedan vid 70 grader Celsius i 10 minuter. Tillsätt 7,5 mikroliter av 2X Taq DNA-polymeras och 0,1 mikromol av RAX, till ett PCR mikrocentrifugrör.Lägg sedan till 0,75 mikroliter var och en av framåt och omvänd primer för att förstärka CCS1-genen. Efter detta, lägga till 600 nanogram cdna mall. Förform förstärkningsreaktionen i realtid PCR enligt beskrivningen i textprotokollet.Analysera sedan data med PCR-programvaran. Väg ut ett gram cellulärt material och packa det i aluminiumfolie. Efter macerating provet, överför den till en glasflaska och tillsätt 2,5 milliliter extraktionsbuffert.Därefter centrifug provet vid 20, 000G i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Överför 500 mikroliter alikvoter till kryogena injektionsflaska. Med en spektrofotometer, mät provs proteinkoncentrationen vid 562 nanometer med hjälp av en bicinchoninsyra-analys, med seriskt albumin från bovin som standard.Först förbereda reaktionsblandningen i ett mikrocentrifugrör, enligt textprotokollet. Sedan, öka den totala volymen till 200 mikroliter med 100 millimolar tris HCL. Kom ihåg, det är absolut nödvändigt för din egen säkerhet att följa ordentliga försiktighetsåtgärder under beredning av reaktionsblandning med radioaktivt material.Håll mikrocentrifugröret på is och tillsätt en volym av den lösliga fraktionen, som innehåller sju till nio milligram protein. Sedan, virvel blandningen och inkubera vid 30 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta centrifugerna proverna vid 11, 000G i fem minuter.Sedan, försiktigt återvinna en volym av 900 mikroliter, och överföra proverna till en scintillation injektionsflaska. Därefter avdunstar kloroformen för att slutföra torrhet i huven vid rumstemperatur. Tillsätt fem milliliter scintillationsvätska till injektionsflaskan.Slutligen, analysera radioaktivitet införlivas i koffeinet med hjälp av en scintillation counter. I detta protokoll, mönstret för absorbans för koffein analyserades via TLC densitometry, genom det synliga ljusspektrumet, och läsning i maximal absorption vid 273 nanometer. Separationskurvan för koffein på TLC-plattan, visade en RF mellan 0,34, och 0,39.RNA som härrör från upphängda celler uppvisar tydliga separationer av 28s, 18s och 5s RRNA subunits, vilket tyder på att proverna var av hög kvalitet. Slutligen erhölls en smältkurva från QPCR-analysen, som visar en enda förstärkningsprodukt för koffeinsyntasgenen. Efter dess utveckling, denna teknik banade väg för forskare inom bioteknik och biokemi att utforska sekundära metabolisera vävnad kultur från kaffe, te och coco.Glöm inte att det kan vara extremt farligt att arbeta med radioaktivitet och molekylär patologi, och försiktighetsåtgärder som användning av handskar, skyddsglasögon och specialutrustning för radioaktivt material ska alltid vidtas när detta förfarande ska göras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Modifiera baculoviridae uttryck vektorer att producera utsöndras växtproteiner i insekt celler

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

En kolorimetrisk analys av Citratsyntas aktivitet i Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Erhålla högkvalitativa transkriptom data från spannmål frön av en modifierad metod för genuttryck profilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Utvinning och kvantifiering av Lösliga, Radiolabeled Inositol Polyfosfater från Olika Växtarter med hjälp av SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...