Name: caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Bizim Laboratuvar çalışmalarını Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS için bir hibe tarafından finanse edildi. Bu araştırma RJPK (No. 37938) CONACyT ve Sistema Nacional de Investigadores (4422) tarafından verilen bir arkadaş grubu tarafından da desteklenmiştir. Yazarlar CIATEJ Bu makale yazma sırasında onun teçhizatları kullanım için teşekkür ederiz. Özel teşekkür Dr Víctor Manuel González Mendoza tesisleri için moleküler biyoloji bölümü ve Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM tüm öneriler için bu makalenin çekimler sırasında genişletilir.

1. kafein çekme içinde hücre süspansiyonlar, C. arabica L.
<ol><li>C. arabica hücre süspansiyonlar9kullanın. Sürekli 100 sürekli ışık (8.3 W/m2) altında 25 ° C'de sallayarak rpm ile pH 4,3 Murashige ve Skoog ortamda iki haftada bir altkültürler tarafından süspansiyonlar bakımını yapar.</li>
	<li>11 µm gözenek filtre kağıdı ve bir Buchner huni kullanarak vakum filtrasyon altında hücre hasat.</li>
	<li>Bir ölçek kullanarak kendine hakim h?...

<ol>
	<li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea.">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy &amp; Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li><li>Majheni&#269;, L., &#352;kerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+and+antimicrobial+activity+of+guarana+seed+extracts.">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li><li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria.">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li><li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache.">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li><li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health.">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li><li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant.">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li><li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis.">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li><li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+irradiation+causes+physiological+and+metabolic+changes+for+purine+alkaloid+production+by+a+Coffea+arabica+cell+suspension+culture.">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li><li>Pech-K&#250;, R., Mu&#241;oz-S&#225;nchez, J. A., Monforte-Gonz&#225;lez, M., V&#225;zquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., Gonz&#225;lez-Mendoza, V. M., Hern&#225;ndez-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L.">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li><li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes.">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li><li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+(Coffea+arabica+L.).">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li><li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves.">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light/dark+cycle+operation+with+an+hour-scale+period+enhances+caffeine+production+by+Coffea+arabica+cells.">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li><li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+formation+by+suspension+cultures+of+Coffea+dewevrei.">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li><li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+content+and+biosynthetic+activity+of+caffeine+and+trigonelline+during+growth+and+ripening+of+Coffea+arabica+and+Coffea+canephora+fruits.">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li><li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gon&#231;alves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit.">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li><li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+(Arabica)+and+Coffea+canephora+(Robusta).">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li></ol>

Burada içerik kafein değerlendirmek için en uygun koşulları mevcut, CS etkinlik ve transkript düzeyleri bir vitro doku kültürü, C. arabicahücre süspansiyonlar gibi bitki. Önceki raporlar Bakımı hücreleri ışık ışınlama altında ve theobromine kültür orta huzurunda kafein, kafein ayırma yöntemleri değerlendirmek edinerek düzeyini artırmak için uygun parametreler olduğunu doğruladı ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) kullanarak. Şu anda hücre s?...

Kafein bitkilerin cins Coffea1tarafından uzarlar olan ikincil bir metaboliti olduğunu. Bu alkaloit methylxanthine ailesine ait ve bu patojenler ve otobur2,3olumsuz etkilerine karşı hareket edebilir çünkü bir kimya fabrikası savunma olarak kabul edilir. Buna ek olarak, bu metaboliti yaygın olarak tüketilen dünya çapında4,5kahve içecek uyarıcı özellikleri için sorumludur. Onun özellikleri nedeniyle, birkaç araştırma grubu biyosentetik yolu ve katabolizma kafein6,7okumak ilgilendi. Şu anda, bitki vitro hücre/doku kültürleri çeşitli biyotik ve abiyotik stratejileri8,9altında kafein birikimi değerlendirmek için bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Kafein biyosentezi içerir tarafından sipariş edilen Ntakip karşılık gelen riboz nükleozit hydrolytic açıklaması, 7-methylxanthine-methylations pozisyonlarda 3 ve 1. Belirli bir S- adenosyl metiyonin (SAM)-bağımlı N-Metiltransferaz (NMT) tromboksan metilasyonu pozisyonda 7, oysa theobromine synthase (TS) ve CS söz konusu olursa 3 - ve 1-methylations yılında, sırasıyla, theobromine üreten ve kafein. Genlerin farklı NMTs kodlama çalışma kafein üretim10,11düzenleyen mekanizması anlama izin verdi. N -metiltransferaz etkinliği olan CS, kafein11biyosentetik yolun son iki adımı tromboksan. Kahve ağacı fidan ışık radyasyon kafein biyosentezi artış sonuçlanır CS etkinlik artırabilir gösterilmiştir. Son zamanlarda, C. arabica L. ışık ışınlama altında hücre Süspansiyonlar bakım kafein8biyosentetik yolu etkileyen abiyotik stres faktörleri üretmek etkilerini değerlendirmek için en uygun koşul olduğunu gösterdi. Bu çalışmalarda elde edilen bilgileri kafein biyosentetik yolu çalışmanın tür vitro sistemlerde maksimize etmek için metabolik Mühendisliği ve sistemleri biyoloji uygulamaları olabilir.
Kafein biyosentezi incelenmesi için uygun bir model alma avantajları göz önüne alındığında, biz C. arabica L. çıkarma koşulları hücre süspansiyonlar kafeini için en iyi duruma getirilmiş Enzimatik aktivite yanı sıra organik kafein synthase bu enzim kodlama 1 (CCS1) gen tutanaklar düzeyini değerlendirmek için metodolojik adımları eğitim için yararlı bir protokolü geliştirmeye mümkündü. Burada, biz ayıklayın ve ince katmanlı Kromatografi ve Dansitometresi (TLC-Dansitometresi) tarafından C. arabica hücre süspansiyonlar kafein ölçmek için bir protokol raporu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:883px;" width="883">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog Basal salt mixture</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td>Packge Size: 50 L 
			Reagent (mg/L) 
			Ammonium Nitrate (1650) 
			Boric acid (6.2) 
			Calcium chloride, anhydrous (322.2) 
			Cobalt Chloride&#8226;H2O (0.025) 
			Cupric Sulfate&#8226;5H2O (0.025) 
			Na2EDTA&#8226;2H2O (37.26) 
			Ferrous Sulfate&#8226;7H2O (27.8) 
			Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) 
			Manganese Sulfate&#8226;H2O (16.9) 
			Molybdic Acid (Sodium Salt)&#8226; 2H2O (0.25) 
			Potassium Iodide (0.83) 
			Potassium Nitrate (1900) 
			Potassium Phosphate, Monobasic (170) 
			Zinc Sulfate&#8226;7H2O (8.6) 
			Supplemented with 
			myo-inositol (100) 
			thiamine (10) 
			cysteine (25) 
			sucrose (30000) 
			2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 
			6-benzylamine purine (1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C0750-5G</td>
			<td>STANDARD-5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Theobromine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T4500</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAMAG TLC Scanner-4</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>27.62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WinCATS Planar Chromatography Manager software</td>
			<td>CAMAG</td>
			<td>1.4.10</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamyl alcohol (24:1)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C-0549</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C4375-13</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>900643</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. BAKER</td>
			<td>9093-03</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>JALMEX</td>
			<td>C-4425-15</td>
			<td>3.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC silica gel 60 F254</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05554.0001</td>
			<td>TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>M6250</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-sodium L- ascorbate</td>
			<td>A4034</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T6066</td>
			<td>1 Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 36.5-38%</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>232227</td>
			<td>Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl [3H]-S-adenosyl methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NET155</td>
			<td>Specific activity of 15 Ci/mmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation vials</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z253081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath/circulator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>60714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifugue tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Tube of 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS23202A</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>LR 5947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain mortar</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB961B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>Z274844</td>
			<td>Porosity medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picofuge</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400550</td>
			<td>2000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>AND</td>
			<td>HR-120</td>
			<td>Model HR-120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel photodocumentation system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Chemic XRS</td>
			<td>Model Chemic XRS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact UV lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95002112</td>
			<td>UVGL-25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scienceware HDPE Buchner funnel</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>2419907</td>
			<td>Type 37600 mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverdAid Reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EP0441</td>
			<td>10000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo (dT)18 primer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#S0131</td>
			<td>100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, RNase-free</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>#EN0525</td>
			<td>1000 U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0191</td>
			<td>R0191</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>K0251</td>
			<td>For 200 reactions of 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PikoReal</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>2.2</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>USB</td>
			<td>J75829</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Karal</td>
			<td>2040</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>64175</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D5758</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>LW Scientific</td>
			<td>Mod. LW210</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caffeine extraction, enzymatic activity and gene expression of caffeine synthase from plant cell suspensions

Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) bir pürin alkaloid popüler içecekler kahve ve çay gibi mevcut olduğunu. Bu Antimikrobiyal aktivite ve doğal bir böcek ilacı olarak kabul edilir çünkü bu ikincil metaboliti kimyasal bir savunma olarak kabul edilir. Kafein Ayrıca çevredeki bitkilerin büyüme engelleyen olumsuz allelopathic etkileri üretebilir. Buna ek olarak, dünyanın her yerinden insanlar kafein analjezik ve uyarıcı etkileri için tüketmek. Kafein teknolojik uygulamalar ilgi nedeniyle bu bileşik biyosentetik yol üzerinde araştırma büyüdü. Bu çalışmalar öncelikle kafein biyosentezi düzenleyen biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları anlama üzerinde odaklanmıştır. Vitro doku kültürü biyosentetik bu yolu çalışmak için kullanışlı bir sistem haline gelmiştir. Bu makale için miktar kafein ve kafein synthase (CS) kodlama transkript düzeyleri gen (CCS1) ölçmek için adım adım bir protokol içinde hücre süspansiyonlar C. arabica L. hem de faaliyete anlatacağız.

Burada sunulan oluşum yolu ile elde edilen kafein özleri TLC-Dansitometresi tarafından Kromatografi Şekil 1' de gösterilen düzenine göre plaka örnekleri subjecting tarafından analiz edildi. Bu bileşik için hücre özleri kafein, bir eğri seviyeleri çeşitli ticari standart konsantrasyonları ile ölçmek için (Şekil 2A) kullanılır. Kafein absorbans desen görünür ışık spektrumu (UV-VIS) maksimum emilim tepe ...

Watch this Scientific Journal Video about Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions at JoVE.com

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Bu iletişim kuralı çıkarma ve miktar hücre süspansiyonlar C. arabica L., kafein için verimli bir metodoloji ve kafein synthase enzimatik aktivite ile ifade düzeyini değerlendirmek için deneysel bir işlem açıklar Bu enzimi kodlayan gen.

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Bu yöntem analitik kimya, biyokimya ve biyoteknoloji alanlarında ki temel soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Kafein biyosentezinde meydana gelen değişiklikler nelerdir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kafein üreten invitro bitki modellerine uygulanabilmektir.Başlamak için, lyophilized hücrelere aseton 10 mililitre ekleyin ve 30 saniye girdap karıştırıcı ile karıştırmadan önce şişe mühür. Daha sonra, oda sıcaklığında beş saat boyunca bir rotator ile 100 rpm örnek karıştırın. Bundan sonra, aseton 25 mikrolitre ile numuneyi yeniden askıya alın.İlk olarak, silika jel plakaları için önceden hazırlanmış kafein ekstresi bir mikrolitre uygulayın. Daha sonra, mobil faz, sikloheksane aseton 10 mililitre ile kromatografi odasında TLC geliştirmek. Kafein bantlarını kompakt bir UV lambası ile kısa dalga boyu ultraviyole ile görselleştirin.Bundan sonra, 273 nanometre densitometri ile kafein düzeylerini ölçmek. Filtre kağıdı kullanarak, vakum filtresi önceden hazırlanmış hücre süspansiyon. Daha sonra, hücre örneğini sıvı nitrojen ve RNA izolasyon reaktifi ile homojenize olana kadar kullanmak için porselen harç kullanın.Daha sonra, numunenin 500 mikrolitresini steril mikro santrifüj tüpüne aktarın. Sonra, kloroform izoamyl alkol 300 mikrolitre ekleyin ve dengeli fenol 300 mikrolitre. Bir girdap karıştırıcı ile karıştırın ve santrifüj 20, 000G dört derece santigrat 15 dakika için.Bundan sonra, temiz bir mikro santrifüj tüpü üst faz300 mikrolitre aktarın. Sonra, 200 mikrolitre isopropanol ekleyin ve tüpü negatif 20 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Pelet etanol bir mililitre ekleyin.Daha sonra tüpü 12,000G'de 10 dakika santrifüj edin ve sıvı fazı ayırın. Daha sonra, oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca numune kuru. Daha sonra, DEPC ile işlenmiş su 25 mikrolitre ile RNA ekstresi yeniden askıya.İlk olarak, steril bir mikro santrifüj tüp toplam RNA ekstresi iki mikrogram ekleyin. Daha sonra, 10X reaksiyon tampon bir mikrolitre ve DNase bir mikrolitre ekleyin. DEPC ile işlenmiş su ile 10 mikrolitre reaksiyonun son hacmini getirin.Sonra, bir dakika için 2, 000G örnek ve santrifüj karıştırın. Sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca örnek kuluçka. Bundan sonra, reaksiyonu durdurmak için 50 mikromkare disodyum etilen dimine dilamin tetraasetat bir mikrolitre ekleyin.Numuneyi 65 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, bir agarose jel için RNA 100 nanogram uygulayın ve jel çalıştırın. Bir jel fotoğraf dokümantasyon sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü görselleştirin.İlk olarak, bir mikro santrifüj tüpüne toplam RNA 2,5 mikrogram ekleyin. Sonra, oligo deoksitimidin astar bir mikrolitre ekleyin ve nükleaz içermeyen su ile 13 mikrolitre son hacmine tüp doldurun. Karışımı örnek ve santrifüj 2, 000G bir dakika için.Numuneyi 65 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Ve sonra dört derecede iki dakika lığına. Daha sonra, numuneye dört mikrolitre 5X reaksiyon tamponu, iki mikrolitre dNTP karışımı ve bir mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.Daha sonra, bir dakika için 2, 000G hafifçe örnek ve santrifüj karıştırın. Bundan sonra, 45 santigrat derecede 50 dakika, sonra 70 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübül. PCR mikro santrifüj tüpüne 7,5 mikrolitre 2X Taq DNA polimeraz ve 0,1 mikromol RAX ekleyin.Daha sonra, CCS1 genini yükseltmek için her biri ileri ve ters astar 0,75 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, 600 nanogram CDNA şablonu ekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi gerçek zamanlı PCR amplifikasyon reaksiyonu Preform.Ardından, verileri PCR yazılımıyla analiz edin. Hücresel malzeme bir gram tartmak ve alüminyum folyo içinde paketi. Numuneyi aldıktan sonra, cam bir şişeye aktarın ve 2,5 mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin.Sonra, 20, 000G dört santigrat derece 20 dakika için örnek santrifüj. 500 mikrolitre aliquot'u kriyojenik şişelere aktarın. Bir spektrofotometre ile, standart olarak sığır seric albumin ile, bir bicinchoninic asit tsay kullanarak 562 nanometre de numunenin protein konsantrasyonu ölçün.İlk olarak, metin protokolüne göre, bir mikro santrifüj tüp reaksiyon karışımı hazırlayın. Daha sonra, 100 milimolar tris HCL ile 200 mikrolitre toplam hacmini artırmak. Unutmayın, kendi güvenliğiniz için radyoaktif madde ile reaksiyon karışımı hazırlanması sırasında uygun önlemleri takip etmek zorunludur.Mikro santrifüj tüpünü buzda tutun ve yedi ila dokuz miligram protein içeren çözünür fraksiyonun hacmini ekleyin. Sonra, karışımı girdap ve 30 derece santigrat 30 dakika kuluçka. Bundan sonra, beş dakika için 11, 000G de numuneleri santrifüj.Daha sonra, dikkatle 900 mikrolitrelik bir hacim kurtarmak ve bir Scintillation vial örnekleri aktarın. Daha sonra, oda sıcaklığında kaputun kuruluğu tamamlamak için kloroform buharlaşır. Şişeye beş mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin.Son olarak, bir sintillation sayacı kullanarak kafein dahil radyoaktivite analiz. Bu protokolde kafein emiciliği, TLC densitometrisi, görünür ışık spektrumu ve 273 nanometrede maksimum emilim de okunarak analiz edildi. TLC plaka kafein ayırma eğrisi, 0.34 arasında bir RF gösterdi, ve 0.39.Askıda hücrelerden elde edilen RNA, 28'ler, 18'ler ve 5'ler RRNA alt birimlerinin açık ayrımlarını sergileyerek örneklerin yüksek kalitede olduğunu gösterir. Son olarak, kafein synthase geni için tek bir amplifikasyon ürünü gösteren QPCR analizinden bir erime eğrisi elde edildi. Bu teknik, geliştirildikten sonra biyoteknoloji ve biyokimya alanlarındaki araştırmacıların kahve, çay ve cocodan ikincil metabolize doku kültürünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.Radyoaktivite ve moleküler patoloji ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven, gözlük ve radyoaktif madde için özel ekipman kullanımı gibi önlemler her zaman alınacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

SAX-HPLC kullanılarak Farklı Bitki Türlerinden Çözünür, Radiolabeled Inositol Polifosfatların Ekstraksiyonu ve Niceliği

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...