Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

السل وزئبق نعترف بالدعم المالي من خلال مجلس البحوث الأوروبية "سيلوفويل، متقدمة المنحة رقم 294438". HCS تسلم الدعم المالي من الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث عن طريق Proteine تيتشنوفونكتيونالي إينوفاتيونساليانز (تيفوبروت)، يقر SS المالية دعم من وزارة الدولة البافارية للعلم والتعليم من خلال تركيز البحوث "هيرستيلونج und بيوفيسيكاليشي تشاراكتيريسيرونج دريديمينسيونالير جيويبي-كانتر". ونحن نشكر كريستوف هاسيلبيرج كوني ومارتينا Hörig للدعم الفني

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

منذ إدخال فؤاد على أساس SMFS، تطورت تقنية تستخدم على نطاق واسع لمباشرة التحقيق البينية وقوات الجزيئات الفردية البروتينات والأحماض النووية وغيرها الجزيئات الحيوية3،،من4من5. للتجارب الناجحة التي SMFS، سطح مناسبة اقتران الاستراتيجية شرطا. للتحقيق أن القوات إينتراموليكولار في البوليمرات الطبيعية والاصطناعية، قد يقترن البوليمرات مباشرة على سطح الركازة وفؤاد نصيحة36،،من3839،،من4041. لتحقيق التفاعلات بين الجزيئات، مثل سندات الجزيئية، بيد أنه من المستحسن استخدام جزيئات رابط مرنة مثل هترو بيفونكشونال شماعة linkers، أو سلاسل ببتيد، تولي الشركاء التفاعل لنصيحة فؤاد سطح الركازة، بغية السماح للتوجه الصحيح للشركاء ملزمة، للتغلب على القوى السطحية قصيرة المدى وتجنب تمسخ وتتكشف من البروتينات21،،من2223، 24،،من2526،،من2742. ولذلك نحن وصف بروتوكول بسيطة ومباشرة إلى الأمام لتجميد التساهمية من البروتينات عن طريق الأمينات الأولية موجوداً استخدام الفواصل شماعة هترو-بيفونكشونال.
نحن أثبت قابليته للتطبيق مع التحقيق في التفاعل القوى بين أدهيسين ررجا من س. الرئوية والبروتين المصفوفة خارج الخلية الجبهة الوطنية، مؤخرا بالتفصيل في أماكن أخرى13.
كيمياء السطح بشكل جيد ونهج تم تحليلها ومماثلة قد استخدمت بنجاح في متعددة SMFS تجارب19،،من4243،،من4445. سيليليثير المستخدمة لاقتران البوليمر سيلاني إلى السطح، ويخضع للتحلل المائي. درجة التحلل المائي يعتمد على مقدار siloxane شكلت السندات التي يمكن السيطرة عليها أثناء عملية سيلانيزيشن. إذا كان من المتوقع خلال قياسات SMFS عالية التفاعل القوى (≥ 1000 السندات الإذنية)، ينبغي سيلانيزيشن المنجزة عن طريق المرحلة بخار ترسب30 الذي يؤدي إلى تشكيل طبقة مستمرة من السيلوكسانات. أما بالنسبة للعديد من التجارب (مثلاً، العديد من البروتين – تفاعلات البروتين)، قوي التفاعل في حدود بضع مئات من السندات الإذنية، ووصف الإجراء، في siloxane التي يضطلع بها ترسبات من مرحلة مائي تشكيل وغير منضم أورجانو-silanes يتم غسله مدروس مع الإيثانول (الخطوة 1.1.7) متبوعاً بالمعالجة بالحرارة (الخطوة 1.1.8)، وهو كاف.
خطوة حاسمة أخرى أن يغسل الصادرات المتبقية وجزيئات دائرة الصحة الوطنية قبالة السطح (الخطوة 1.2.3)، بقايا الطعام سوف يؤدي إلى تنشيط مجموعات الكربوكسيل في البروتينات. وهذا قد أما النتيجة في كروسلينكينج من البروتينات على السطح نفسه، والتي يمكن أن تغير من وظيفة كل منها أو تساهمي زوجين تنشيط البروتينات إلى غيرها من البروتينات على سطح المعاكس. قد يؤدي هذا إلى لقط البروتينات بين السطح ونصيحة فؤاد، الذي يؤدي إلى تمزق عالية القوات ربما مصحوبة بالمجال تتكشف (انظر الشكل 3b، تتبع 1 و 4 و 5، تتكشف من المجالات Fn)46. يمكن أن تحدث نفس المشكلة، إذا تركت استرات دائرة الصحة الوطنية النشطة من مباعدة شماعة غير المشبعة. ولذلك، الحضانة مع تريس مخزنة المالحة ينصح (الخطوة 1.2.6)، كما يروي أمين الأولية من تريس المجموعات المتفاعلة الأمينية المتبقية.
يتبع البروتوكول تدريجي يؤدي إلى توزيع متجانس للجبهة الوطنية على زجاج سيلانيزيد السطحية (انظر الشكل 2)، ترك نموذج ديميريك من البروتين. هذا يشبه هيكل Fn´s في الحل ومتسقة مع البيانات السابقة فؤاد على السطوح عينة أخرى37. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الحصول عليها بتركيز مناسب من ررجا على نصيحة فؤاد، الذي يولد قيمة هدف ~ 20 ٪ من أحداث تفاعل محددة تحديداً جيدا خلال قياسات SMFS (رقم 3 و رقم 4). طريقة أنيقة أخرى للتحكم بكمية الجزيئات بالإضافة إلى نصيحة الركيزة وناتئ عينة إلى جانب متفاوتة الأوقات البروتين تركيز و/أو الحضانة، هو مزيج وكلاء سيلاني مع مختلف المجموعات الوظيفية الثانوية. عن طريق تغيير نسبة البروتين الجماعات المتفاعلة تمتد من شماعة-البوليمر، يمكن أن يكون عدد البروتينات المعطل تداولها التي تسيطر عليها15،16،،من1718.
يمكن أيضا استخدام البروتوكول الموصوفة هنا شل الجزيئات الأخرى التي تحتوي على2 -NH أو تعديلها للزوجين البروتينات على سطح أكسيد السيليكون الأخرى إلى جانب نيتريد السيليكون والزجاج. استناداً إلى تصميم البروتين، مجموعة الكربوكسيل رد الفعل أمين يمكن تغييرها إلى فريق رد الفعل سلفهيدريل (ثنائي كبريتيدمثلاًأو ماليميدي أو اورثو-بيرديدل) لزوجين البروتين عن طريق الحر-مجموعات SH. للجبهة الوطنية، وهذا يؤدي في اتجاه المعرفة مسبقاً13،17،20.
باختصار، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لتلبية احتياجات مختلف وهو مناسبة للتطبيقات الفيزيائية الحيوية الأخرى إلى جانب تجارب التحليل الطيفي قوة جزيء واحد.

بجوار ملاقط الضوئية والمغناطيسية، قد برز كأداة مفيدة لتحليل ومعالجة جزيئات القوة الذرية المجهر (فؤاد)1،2 والتحقيق خصائص ووظائف، بما في ذلك الرد على قوة خارجية3 ،4. في المقابل إلى أساليب مثل مقايسة الممتز مرتبط الإنزيم (إليزا)، السطح الرنين مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة) أو كريستال الكوارتز ميكروبالانسي (QCM) الأجهزة، فؤاد يسمح لقياس التفاعلات في جزيء واحد (SMFS)5 والمستوي خلية مفردة (سكفس)6 . هذه التكنولوجيات أسفرت عن نظرة متعمقة في آليات ملزمة مثل السندات الصيد التي وجدت للتفاعل بين البروتين الهياكل كولاي فيمه مع يطلق7، أو جنبا إلى جنب β-الزمام ويكرر شكلتها الجبهة الوطنية ملزم البروتينات من المذهبة س. عند الربط إلى الجبهة الوطنية8. وقد تمكنا مؤخرا تبين أن أدهيسين الهياكل-1 ررجا9،10 من بكتيريا إيجابية العقدية الرئوية (س. نيمونيا)11 قادرة على ربط فيبرونيكتين12 مع أن هذين المجالين المحطة الطرفية. وكشف هذا عن إليه ملزمة المجال الثاني جديد الذي يختلف عن β-الزمام جنبا إلى جنب، وقد تمكن بنيوموكوكسي بيلياتيد لتشكيل والحفاظ على سطوح مضيف اتصال باحتواء فيبرونيكتين عابر13.
نجاح تجارب SMFS نقديا يعتمد على تجميد وظيفي وأصلي الجزيئات الحيوية على السطوح الصلبة ونصائح فؤاد. كما قد يحدث قوات عالية خلال قياسات SMFS، البروتينات ينبغي أن يفضل أن تساهمي يقترن إلى السطح. وهناك عدد كبير من أساليب مختلفة من اقتران للتثبيت من البروتينات وغيرها من الجزيئات الحيوية، فضلا عن الخلايا كلها على السطوح الصلبة (غير العضوية)، جسيمات نانو وغيرها من الأجهزة المذكورة في الأدب14،15 ،16،17،،من1819،20،21،،من2223،24، 25،،من2627. غالباً ما تجعل هذه البروتوكولات تستخدم المواد الخطرة، ويصعب تنفيذ و/أو تتطلب معدات خاصة (مثلاً، البلازما أنظف). طريقة بسيطة للزوجين جزيئات الزجاج إرفاق طبقة بوليمر أكثر سمكا من كروسلينكيرس هيتيروبيفونكشونال مع مجموعة سيلاني--رد الفعل على جانب واحد وجماعة أمين-القائم على رد الفعل على الجانب الآخر. اعتماداً على التطبيق، يمكن أن تشمل العوامل اقتران سلاسل الكربون المائية مرنة متغيرة الطول، على سبيل المثال-، بوليثيلينجليكول (الربط). قمع التفاعلات غير محدد الأسطح تم التعديل (مثلاً، الماء، والكهرباء والتفاعلات فإن-دير-فالس)، وقد توفر حرية جزيء يزوج التناوب.
وهنا، يمكننا وصف بروتوكول عام لاقتران التساهمية من البروتينات التي تحتوي على واحد أو أكثر من المجموعات الأمينية الحرة (-NH2) الزجاج السطوح ونصائح نيتريد السيليكون فؤاد عبر هيتيروبيفونكشونال اثوكسي سيلاني-شماعة-الكربوكسيل (-COOH). يمكن استخدام هذا البروتوكول في تجارب SMFS، الذي يتمثل استناداً إلى التفاعل بين ررجا والبروتين المصفوفة خارج الخلية الجبهة الوطنية (انظر الشكل 1 لمحة عامة).
والخطوة الأولى هي سيلانيزيشن السطحية28،،من2930،31. أنها تنطوي على التحلل المائي لمجموعات اثوكسي عامل اقتران بغية تشكيل مجموعات سيوح عالي التفاعل. وهذه يمكن أن تتفاعل مع مجموعات سيوح على الركازة. في تكثيف الأولية خطوة، هذه السندات الهيدروجين النموذج سيلانولس وانتشرت على الركازة. في رد فعل تكثيف ثانوي (الذي عادة ما يتطلب الحرارة أو فراغ لإزالة الماء)، شكلت سندات siloxane. هذه النتائج في طبقة سيلاني organo تساهمي مرفقة.
والخطوة الثانية هي اقتران البروتينات للوظيفية (-COOH) المجموعات التي تمتد من البوليمر32. أولاً، يتم تحويل الحامض إلى رد الفعل N-هيدروكسيسوكسينيميد (NHS) إستر وسيطة، المكتسبة من خلال دائرة الصحة الوطنية الراسخة/تنمية الصادرات (1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) كاربودييميد الكيمياء33 ويخضع لتفاعلات الاستبدال وأخيراً تشكيل في سندات أميد مع الأمينات الأولية على البروتينات.
وبهذه الطريقة، كان ررجا بالإضافة إلى نصائح فؤاد نيتريد السيليكون والجبهة الوطنية البشرية إلى ركائز زجاجية في اتجاه عشوائي وحللت قواتهما التفاعل على مستوى جزيء واحد. وتظهر النتائج التي توصلنا إليها أن وصف الكيمياء السطحية يؤدي إلى توزيع الجبهة الوطنية بصورة متجانسة على سطح الزجاج بتركيز مناسب من ررجا على الحافة، الظاهر بقيمة تصل إلى 20 في المائة أحداث التفاعل من خلال قياسات SMFS الهدف. هذا الكيمياء يقلل التفاعلات الخلفية غير محددة، ويخضع للتغيير قليلاً أثناء الحصول على البيانات وبالتالي ممتاز يناسب دقة SMFS التجارب.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

في السنوات الأخيرة، إلى مجهر القوة الذرية (AFM) جزيء واحد قوة التحليل الطيفي (SMFS) توسيع فهمنا للخصائص الجزيئية ووظائفها. فإنه أتاح لنا الفرصة لاستكشاف تعدد الآليات الفيزيائية، مثلاً، كيف البكتيرية أدهيسينس ربط المستقبلات السطحية المضيف بمزيد من التفصيل. من بين عوامل أخرى، يتوقف نجاح تجارب SMFS على التثبيت الوظيفية وأصلي من الجزيئات الحيوية للفائدة على السطوح الصلبة ونصائح فؤاد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيط لاقتران التساهمية من البروتينات للأسطح السيليكون باستخدام سيلاني-شماعة-كاربوكسيلس والكيمياء N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (مؤسسة/دائرة الصحة الوطنية) راسخة في النظام لاستكشاف التفاعل بين الهياكل-1 أدهيسين ررجا من بكتيريا إيجابية العقدية الرئوية (س. نيمونيا) مع فيبرونيكتين البروتين المصفوفة خارج الخلية (الجبهة الوطنية). النتائج التي توصلنا إليها تظهر أن الروغان السطحية يؤدي إلى توزيع الجبهة الوطنية بصورة متجانسة على سطح الزجاج بتركيز مناسب من ررجا على طرف ناتئ فؤاد، الظاهر بقيمة تصل إلى 20 في المائة أحداث التفاعل أثناء SMFS الهدف القياسات وكشفت عن أن ررجا تربط بين الجبهة الوطنية بقوة يعني 52 pN. ويمكن تعديل البروتوكول للزوجين عن طريق مجموعات المواقع ثيول الحرة محددة. هذه النتائج في اتجاه بروتين أو جزيء المعرفة مسبقاً وهو مناسبة للتطبيقات الأخرى الفيزيائية الأحيائية إلى جانب SMFS.

وصف البروتوكول هنا النتائج في تجميد التساهمية من البروتينات عن طريق تلك الأمينات الأولية موجوداً مع اتجاه عشوائي (الشكل 1). الشكل 2 يوضح صورة فؤاد سطح الزجاج سيلانيزيد مع (يسار) وسجلت دون الجبهة الوطنية (يمين) معطلة، بعد جفاف العينات تحت تيار لطيف من النيتروجين. طبقة البوليمر سيلاني يوضح فقط الصغيرة كوروجاتيونس السطح بارتفاع حوالي 2-5 نيوتن متر (الشكل 2، حق)، بينما على سطح فونكتيوناليزيد مع الجبهة الوطنية، وهي حوالي 10 نانومتر عالية Fn جزيئات الظاهر (الشكل 2، يسار). في مقربة، يمكن التعرف على هيكل ديميريك من الجبهة الوطنية. يبدو أن الجزيئات Fn المدمجة مع ارتفاع 4-5 نانومتر أعلاه طلاء السطح شماعة وطول ~ 120 نانومتر (انظر إدراج).
للتحقيق في تفاعل قوي ررجا مع الجبهة الوطنية، التي وصفت بالتفصيل مؤخرا لدينا مجموعة13، اقترن ررجا إلى نصيحة فؤاد نيتريد السيليكون والجبهة الوطنية البشرية إلى الركيزة الزجاج (الشكل 3a). ويبين الشكل 3 نصيحة الممثل منحنيات فصل عينة من تفاعل ررجا مع الجبهة الوطنية المسجلة سرعة سحب من 1 ميكرومتر s-1. الكيمياء السطحية المستخدمة أدى إلى وجود تفاعل خلفية منخفضة وأحداث التفاعل جيدا على شكل واحد (أو مزدوج) (الشكل 3 أ)، التي كانت مزودة باستخدام دودة الموسعة مثل سلسلة (أولك) طراز (المنحنيات الحمراء). التآمر نتائج تناسب (تمزق القوة-والطول، انظر الشكل 4) يبين أن بعد التغلب على التفاعلات السطحية غير محددة بين نصيحة فؤاد والركيزة، وتمتد linkers شماعة (> 70 nm)، ما يصل إلى ~ 19% منحنيات القوة أظهرت تمزق الأحداث مع تمزق متوسط القوة ررجا-تفاعل Fn ~ pN 52 مسافات تلميح-عينة من حوالي 100 نانومتر. وفي المقابل، كيمياء سطحية غير قابل للتطبيق (هنا، تبريد مهملة مع تريس مخزنة المالحة الشكل 3b) سوف تحول دون إجراء تقييم واضح لإحداث تفاعل واحد بسبب التفاعلات غير محدد، متعددة البروتين ملزمة (تتبع 2 و 3) و/أو اقتران التساهمية البروتينات بين سطح العينة وطرف ناتئ فؤاد. هذا يؤدي إلى تمزق عالية قوات (تتبع 1) يرافقه ربما تتكشف نطاقات البروتين (الجبهة الوطنية) (تتبع 4 و 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> رقم 1: نظرة عامة على كيمياء السطح. أن التحلل من اثوكسي سيلاني-شماعة-الكربوكسيل متبوعاً التكثيف في سطح الزجاج رطب وتشكيل siloxane crosslinks. رد فعل لتنمية الصادرات مع مجموعات الكربوكسيل يؤدي رد الفعل س-أسيليسوريا، وسيط أمين المتفاعلة مع العمر النصفي له قصيرة للغاية في المحلول (التحلل المائي). واستقرت المتوسطة بتشكيل إستر الصحي الذي يخضع لتفاعلات الاستبدال وأخيراً تشكيل في سندات أميد مع الأمينات الأولية على البروتينات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> الشكل 2: التثبيت فيبرونيكتين على زجاج الركازة عبر هيتيروبيفونكشونال اثوكسي سيلاني شماعة عامل اقتران الكربوكسيل. صور فؤاد من الزجاج فونكتيوناليزيد السطوح مع (يسار) ودون (حق) تشير الأرقام Fn. إلى جزيئات الجبهة الوطنية الفردية، التي توزع البلوتينيوم على سطح الركازة (إدراج). الجزيئات اعتماد هيكل ديميريك والاتفاق مع ارتفاع من شمال البحر الأبيض المتوسط 4-5 أعلاه شماعة طلاء وطول > 100 نانومتر. وهذا يشبه هيكل الجبهة الوطنية في الحل ومتسقة مع البيانات السابقة فؤاد على الأسطح الأخرى، مثلاً، والميكا (شريط مقياس لتطعيم = 500 nm)37. فيما يلي صور فؤاد التشكيلات الجانبية للارتفاع على النحو المبين في الصور فؤاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> الشكل 3: توضيح لتجربة SMFS وممثل القوة منحنيات المسافة من ررجا-التفاعل Fn. (أ) ررجا والجبهة الوطنية كانت مرتبطة تساهميا عبر سيلاني اثوكسي هيتيروبيفونكشونال شماعة عامل اقتران الكربوكسيل إلى نيتريد سيليكون فؤاد تعزية نصيحة وسطح زجاج، على التوالي. SMFS ممثل القوة المسافة تظهر المنحنيات الحصول على ررجا--الجبهة الوطنية التفاعل سرعة تراجع من 1 ميكرومتر s-1 مع التثبيت وصف ررجا والجبهة الوطنية. تمثيل المنحنيات الحمراء يناسب الموسعة مثل دودة السلسلة تطبق على الحصول على قوات تمزق وأطوال. تم تعديل الرقم من بيك, et al., 2018 أكسنانو13. (ب (SMFS ممثل القوة منحنيات المسافة التي تم الحصول عليها ررجا--الجبهة الوطنية التفاعل دون تبريد مع تريس مخزنة المالحة. وفي هذه الحالة، أمين الأولية من تريس كان غائبا حتى أن تبقى نشطة استرات المستشفيات العامة تركت غير المشبعة أثناء التجربة. وادي ذلك إلى متعدد بروتين ملزمة (تتبع 2 و 3) ولقط البروتينات بين السطح ونصيحة فؤاد مما أدى إلى تمزق عالية القوات المجال مصحوبا (-الجبهة الوطنية) التي تتكشف (تتبع 1 و 4 و 5؛ ملاحظة مقاييس مختلفة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> رقم 4: توزيع القوة وطول واحد ررجا-التفاعلات Fn. تمزق القوة ورسوم بيانية طول تمزق المقابلة التي تم الحصول عليها من ررجا-Fn SMFS التفاعل القياسات (n = 1400) سرعة تراجع من 1 ميكرومتر s-1. رسوم بيانية تكشف عن قوة تمزق الأكثر احتمالاً والنائب من 51.6 pN (تناسب غاوس، الخط الأسود) وتراكم تمزق أطوال حوالي 100 نانومتر. تم تعديل الرقم من بيك, et al., أكسنانو, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

يصف هذا البروتوكول تجميد التساهمية من البروتينات مع سيلاني هيتيروبيفونكشونال اقتران وكيل للأسطح أكسيد السيليكون مصممة للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد مجهرية على أساس القوة الذرية الذي يتجلى تفاعل ررجا (تلميح الهياكل-1 أدهيسين من الرئوية س) مع فيبرونيكتين.

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...