Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

TB og HG anerkende finansielle støtte gennem det Europæiske Forskningsråd "Cellufuel, avancerede Grant No. 294438". HCS anerkender finansiel støtte fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning gennem Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS anerkender finansiel støtte fra den bayerske stat Ministeriet for videnskab og uddannelse gennem forskningsfokus "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - galop". Vi takker Conny Hasselberg-Christoph og Martina Hörig for teknisk support

1. immobilisering af proteiner via funktionel silan kobling agenter
Bemærk: Figur 1 giver en oversigt over overfladen kemi anvendt i denne protokol.
Forsigtig: I de følgende protokol, forskellige kemikalier med ætsende og hud irriterende egenskaber er brugt. Bære passende (syrefast) handsker, beskyttelsesbriller og laboratoriekittel og arbejde under stinkskab samtidig med at forberede løsninger for at undgå indånding af dampe.
<ol><li>Functionalization af glasoverflader og silicon nitride cantilever med silan kobling agenter<ol>
<li>Fjern grove støv og forureninger fra glas dias med isopropanol og fnugfri præcision wipes og skåret dias i ønskede størrelse (valgfri). Bemærk: Ved siden af glas, solid overflade kan være kvarts, kvarts og oxider af aluminium, kobber, tin, titanium, jern, krom, zirkonium, nikkel og zink. Forsigtig: Skære glas dias kan forårsage skarpe kanter.</li>
		<li>Sted på glas dias i en farvnings-krukke fyldt med saltsyre (33% HCl) fortyndes med dobbeltdestilleret vand (ddH2O) til 3-5% (v/v), Luk krukke med passende låg og anbringes i ultralydbad i 90 min ved stuetemperatur. Bemærk: Den anvendte krukken har en diameter på 6 cm og et omtrentlige størrelse af 65-70 mL. En passende mængde af fortyndet HCl til krukken er 50 mL indeholder 5 mL 33% HCl og 45 mL af Hedeselskabet2O. HCl effektivt fjerner ikke-bindende metal ioner, især natrium, kalium og calcium og reducerer silicium for at producere en hydroxyl mættede barometer overflade. Forsigtig: HCl er ætsende og hud irriterende. Bære passende syrefast handsker, beskyttelsesbriller og laboratorium pels og arbejde under stinkskab samtidig med at forberede løsningen for at undgå indånding af dampe.</li>
		<li>Placer silicon nitride AFM cantilever sonder i et rent glas dias med spidsen opad og bestråle med ultra violet lys fra oven til mindst 90 min. Bemærk: For enkelt molekyle kraft spektroskopi, udkragninger med en nominel foråret konstant af 0,01 til 0,1 N m-1 er egnet. Bestråling af cantilever overfladen med UV-lys vil fjerne organiske forureninger, hovedsageligt fedt stoffer, og gøre den hydrofile på den ene side. Hvis anden siden er stærkt forurenet - der bør ikke være tilfældet, eller hvis cantilever sonderne anvendes friske ud af leverandørernes box - det kan påvirke SMF'ER måling. En grundig rengøring af hele cantilever chip bruger piranha løsning, som har været brugt i mange studier34, kan hjælpe. Forsigtig: UV-lys er skadelige for øjnene; bestråling af cantilever sonderne bør derfor udføres i en UV lys uigennemtrængelige kammer. Piranha løsning er meget reaktive og kan brænde huden, papir og andet organisk materiale. Brug ikke plastbeholdere. Hvis i retter eller krukker selv med små mængder af økologisk overflade forureninger (f.eks.fra tidligere anvendelse), kan det reagere hurtigt.</li>
		<li>Erstat saltsyre i farvning krukken med ddH2O uden at lade glasoverfladen tørre og Anbring krukken tilbage i ultralydsbad for en anden 10 min. erstatte vandet to gange mere i 10 min. henholdsvis til korrekt vaske saltsyre syre.</li>
		<li>I mellemtiden opløses ethoxy (eller methoxy) silan polyethylenglycol syre (Si (OC2H5)3-PLØK-COOH) i en blanding af ethanol og Hedeselskabet2O (v/v 95% / 5%, pH 4.6 justeret med eddikesyre) til en endelig koncentration på 0,1 mg mL -1. Gemme løsningen hermetisk forseglet for at undgå fordampning af ethanol. Bemærk: Silan kobling agenter er følsomme over for fugt og temperatur. Derfor skal de opbevares under anvendelse af inaktiv gas (N2), ved lav temperatur (-20 ° C) og under tørre forhold. Før du åbner kolben, Sørg for at silanerne har nået stuetemperatur for at minimere hydrering og dermed passivation af reaktive grupper. Heterobifunctional PLØK kobling agenter er tilgængelige med mange forskellige funktionelle grupper og forskellige spacer længder. For tilfældige immobilisering af proteiner via skal deres frie amino grupper (NH2), som beskrevet i denne protokol, den funktionelle gruppe yderligere til ethoxy/methoxy silan være en NHS ester. Ved køb af en silan agent med NHS ester, en simpel måde at få sådanne NHS ester er at aktivere en carboxyl gruppe (-COOH) med 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) og NHS (Se 1.2.1. og 1.2.2.). OBS: Ethanol er brandfarlige og hud irriterende. Eddikesyre er brandfarlige og ætsende. Passe på ikke for at få reaktive silaner på huden eller i øjnene. Bære passende handsker, beskyttelsesbriller og laboratoriekittel og arbejde under stinkskab for at undgå indånding af dampe.</li>
		<li>Hæld silan løsning i to separate petriskåle, Placer forberedt cantilever sonder og glas dias i en petriskål henholdsvis, forsegle hermetisk (fx parafilm) at undgå fordampning af ethanol, og der inkuberes stationære for 90 min. ved stuetemperatur. Bemærk: Den optimale størrelse af petriskålen afhænger af antallet af cantilever sonder og størrelsen på glas dias, der skal være functionalized. En diameter størrelse for god håndtering og lav reagens volumen er 50-60 mm. For at undgå uønskede bøjning af cantilever mens trænge gennem grænsefladen luft vand af udlægget skal holdes i en 90° vinkel til grænsefladen luft-vand. Inkubation af glas dias (men ikke cantilever sonderne) kan eventuelt foretages på en orbitalryster.</li>
		<li>Skyl cantilever og glas dias i tre på hinanden følgende bægre indeholder ren ethanol til helt at vaske de ubundne silan forbindelser. Bemærk: For at undgå uønskede bøjning af cantilever mens trænge gennem grænsefladen luft vand, af udlægget skal holdes i en 90° vinkel.</li>
		<li>Placer functionalized glas dias i farvning krukken og cantilever på en ren glas dias og helbredelse ved 110 ° C i 30 min. Bemærk: Hærdning med varme inducerer dannelsen af kovalent siloxan obligationer og fjernelse af vand. Som glas dias var kun functionalized på den ene side, Sørg for at korrekt angive den coatede side.</li>
		<li>Gemme TOT silaniseret glas prøver og cantilever sonder i et vakuum ekssikkator til op til en uge. Bemærk: Protokollen kan pause her.</li>
	</ol></li>
	<li>Tilfældige immobilisering af proteiner på TOT silaniseret glas og silicon nitride cantilever Bemærk: For at undgå uønskede bøjning af cantilever, cantilever sonden holdes i en 90° vinkel mens gennemtrængende nogen luft-vand grænseflader.<ol>
<li>Udarbejde en løsning der indeholder 42 mg mL-1 af EDC og 20 mg mL-1 NHS i standard fosfatbufferet saltopløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). Advarsel: EDC er ætsende og hud irriterende og kan forårsage alvorlige øjenskader. Bære passende handsker, beskyttelsesbriller og laboratoriekittel.</li>
		<li>Cover silane belagt glas dias med løsningen og sætte TOT silaniseret cantilever sonder i en dråbe af EDC/NHS opløsning og inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur. Bemærk: Til inkubation af cantilever sonderne, boksen oprindelige cantilever er egnet. Til par proteiner via deres frie amino grupper til carboxyls (-COOH) af heterobifunctional silan-PIND agenter, gruppen - COOH er aktiveret med at himmelvidt anvendte EDC/NHS kemi. EDC par NHS til carboxylsyre, danner en "stabil" NHS ester, der giver mulighed for effektiv konjugation til primære aminer ved fysiologisk pH i et næste skridt.</li>
		<li>Skyl cantilever og glas dias grundigt med PBS i tre på hinanden følgende bægre for at helt vaske af overdreven EDC/NHS. Bemærk: Denne vask skridt er kritiske som resterende EDC/NHS kan bitmapgenkendelse proteiner og ændre dermed deres funktionalitet.</li>
		<li>Glassene inkuberes aktiveret glas med og cantilever sonder i en dråbe af det ønskede protein løsning i en våd kammer ved rumtemperatur. Protein koncentration og inkubering tid bør tilpasses kravene til eksperimentet. Generelt er en fusion mellem 0,5 til 1 mg mL-1 og inkubation times fra 30 min til 2 h er velegnet til de fleste proteiner. Fibronektin (på glas dias) og pilus-1 tip protein RrgA (på cantilever), en kindtand koncentration af 1,5 µM og 3 µM, henholdsvis, og en inkubationstiden for 2 h er tilstrækkelig.</li>
		<li>Vaske glas lysbilleder og af udlægget sonder grundigt med PBS i tre på hinanden følgende bægre for at vaske af ubundne proteiner.</li>
		<li>Mætte den resterende NHS ester med tris (hydroxymethyl)-aminomethan ved at placere sonderne i tris-bufferet saltvand (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) i 20 min. ved stuetemperatur. Bemærk: Dette trin reducerer uønskede kovalente kobling af proteiner mellem functionalized overfladen af AFM tip og glas, fordi amino grupper af Tris kan binde sig til de resterende aktiverede COOH grupper på cantilever og substrat overfladen.</li>
		<li>Vaske glas lysbilleder og af udlægget sonder grundigt med PBS og gemme dem i separate petriskåle dækket i PBS indtil brug. Bemærk: Prøverne bør være forberedte frisk og brugte den samme dag.</li>
	</ol></li>
</ol>2. atomic Force mikroskopi baseret enkelt molekyle kraft spektroskopi
Bemærk: I dette arbejde, en atomic force microscope fra KURIA instrumenter blev brugt og sæt ups for at få kraft-afstand kurver blev defineret med den gældende RampDesigner.
<ol><li>Cantilever kalibrering med termiske støj metode35 Bemærk: For cantilever kalibrering, Følg trin i vejledningen fra fabrikanten. De fleste cantilever leverandører staten en omtrentlig foråret konstant, der er som regel beregnet ud fra den nominelle cantilever form (længde, bredde, tykkelse) og er derfor ikke meget pålidelig. Som den korrekte forår konstant er afgørende, er det tilrådeligt at foretage udlægget kalibreringen beskrevet nedenfor i tre eksemplarer og bruge middelværdier af optiske løftestang følsomhed og foråret konstant. Det kan være nyttigt at registrere cantilever afbøjning i volt (V) i løbet af eksperimentet og konvertere det til at tvinge (pN) bagefter, ved hjælp af optisk løftestang følsomhed og foråret konstant betyde værdier. Foråret konstant og optisk løftestang følsomhed kan bestemmes før og efter forsøget, så længe laser holdning ikke er ændret på cantilever (placeringen af det reflekterede laser kan justeres på fotodiode).<ol>
<li>Lave en ren, frisk glas dias på prøveholderen AFM og dække det med PBS buffer. Bemærk: Kalibreringen gennemføres på en hård overflade (fx, glas) og i den samme buffer som de faktiske eksperimenter.</li>
		<li>Fix rede cantilever sonden på cantilever indehaveren, placere den i AFM hoved og grundigt våd cantilever med en dråbe af PBS buffer. Bemærk: Befugtning af cantilever nedsætter overfladespænding optræder under penetration i PBS buffer på kalibrering glas dias og dermed uønskede bøjning af cantilever.</li>
		<li>Langsomt flytte cantilever mod kalibrering overflade, indtil cantilever er helt nedsænket i PBS buffer, men stadig væk fra kalibrering overflade.</li>
		<li>Bruge ovenfra optisk mikroskop af AFM eller (hvis tilgængelig) inverteret mikroskopet nedenunder AFM placere laser af AFM på bagsiden af cantilever. Placer laser spot nær slutningen af cantilever tæt på hvor spidsen er placeret. Bemærk: Laser spot skal være placeret tæt på slutningen af af udlægget, men det bør stadig være helt på cantilever. Hvis ingen optisk mikroskop er tilgængelig, bruger et stykke papir til synlig laserdioder eller en laser detektor kort til infrarød laserdioder, sætte det nedenunder AFM hoved og flytte laser spot mod kanten af cantilever-chip, hvor udkragninger er placeret , indtil du kan se stedet på kortet papir eller detektor. Derefter flytte laser parallelt med kanten. Når stedet forsvinder, er det på en justerbare arm. For lineær udkragninger, flytte stedet i slutningen af løftestang arm indtil det vises på papir/detektor kortet og flytte den tilbage indtil det er igen på løftestang arm (forsvinder fra papir/kort). For trekantede, placere plet i midten mellem to arme af cantilever og flytte den hen imod slutningen af udlægget, indtil det forsvinder fra papir/kort. Kontrollér, at du er i midten af udlægget ved at flytte den spot vinkelret på denne akse af cantilever.</li>
		<li>Justere placeringen af fire kvadrant detektor fotodiode af AFM på en sådan måde, at den reflekterede laserstråle er placeret i midten af en fotodiode. Bemærk: Fortsættes som følger: Brug mikrometer skruer nær detektor diode til at flytte dioden i vandret og lodret retning, indtil summen signalet fra alle fire kvadranter er maksimeret. Derefter flytte diode i lodret retning, indtil vertikal afbøjning signal er nul, og flytte dioden i vandret retning, indtil det tværgående afbøjning signal er nul. Silicon nitride udkragninger normalt har en guld belægning og er derfor en bimetal med to forskellige koefficienter, der termisk ekspansion. Dette resulterer i en termisk drift (tilsyneladende i vertikal afbøjning signal) især i løsning. For at reducere denne drift under målingerne, lade hele systemet Blandingen henstår i et par minutter før du starter kalibrering.</li>
		<li>Åbn kalibrering manager i AFM software og kalibrere cantilever følsomhed og foråret konstant af cantilever med metoden, der termisk støj som følger.</li>
		<li>Omhyggeligt tilgang substrat overflade og optage en kraft-afstand kurve.</li>
		<li>Bestemme den optiske løftestang følsomhed i nm/V ved at montere en lige linje til den stejleste del af retraktion kraft kurve, hvor spidsen er i kontakt med underlaget overflade. Følsomhed giver mulighed for at konvertere cantilever foråret konstanten at pN/nm. Bemærk: Hældningen af retraktion kurve er piezo rejse afstand vs. ændring i fotodiode spænding (målt i nm/V).</li>
		<li>Optage flere termiske støj spektre af cantilever med cantilever ca 100 µm eller mere væk fra overfladen for at udelukke enhver overflade dæmpning.</li>
		<li>Bestemme konstanten foråret af udlægget i pN/V ved at montere en harmonisk oscillator leveres af AFM software til termiske støj spektre.</li>
		<li>Langsomt trække cantilever og trække det tilbage fra løsningen.</li>
		<li>Stedfortræder glasoverfladen anvendes til cantilever kalibrering med prøveoverfladen indeholdende de immobiliserede proteiner. Sørg for, at af udlægget og prøveoverfladen (og derved af proteiner) tør ikke mens du ændrer glas lysbilleder.</li>
	</ol></li>
	<li>Interaktion tvinge eksperimenter på enkelt protein-niveau<ol>
<li>Langsomt flytte den fugtige cantilever mod prøveoverfladen indtil cantilever er helt dækket af PBS buffer, men stadig væk fra substrat overflade. Bemærk: For at reducere den termiske glider under eksperimentet, lad det hele system sat i et par minutter før du starter kraft spektroskopi målinger.</li>
		<li>Henvende sig til overfladen og optage flere kraft-afstand kurver (≥ 500) på forskellige steder af prøveoverfladen, med en kontaktkraft af 250 pN, en kontakttid 1 s, en retraktion længde på 2 µm og en retraktion hastighed på 1 µm s-1. Bemærk: For generelle kraft spektroskopi justeringer, Følg fabrikantens vejledning. Variationer: Retraktion hastighed kan varieres mellem 0,1 og 5 µm s-1 for at beregne kinetical data afhængigt af den stigende force belastning. Interaktion tid kan varieres for at analysere tid afhængige bond styrke. I stedet for at holde retraktion hastighed konstant, kan man holde konstanten kraft (force klemme tilstand).</li>
	</ol></li>
	<li>Dataanalyse Note: Dataanalyse blev udført ved hjælp af edb-software. Afhængigt af de immobiliserede proteiner, den kontakttid eller retraktion hastighed, hvorvidt eller ikke var indarbejdet på et fodaftryk og andre variable parametre, indeholder kraft-afstand kurver flere forskellige oplysninger. Data-analyse og fortolkning kan variere meget mellem forskellige SMF'ER eksperimenter og kan derfor ikke være beskrevet i detaljer her. Med hensyn til samspillet mellem RrgA og Fn kan følgende protokol være et første skridt til analyse af SMF'ER data.<ol>
<li>Åbn den målte kraft kurve filer ved at vælge ikonet Åben Batch af tvinge Skan og behandle kraft-afstand kurver som følger:</li>
		<li>Konvertere cantilever afbøjning (V) til den direkte proportional kraft (F) ved at vælge ikonet (Re) Kalibrer V-afbøjning af justering af følsomhed og foråret konstant . Bemærk: Hvis cantilever kalibrering blev udført før forsøget, værdierne gemmes i kraft scanningsfiler og bruges automatisk ved kalibrering af V-afbøjning. Hvis kalibreringen blev udført efter forsøget, bruger softwaren standardværdier, som kan ændres til de målte værdier.</li>
		<li>Subtrahere baseline af retraktion kanal i en region i kraft kurven langt fra overfladen til at indstille niveauet nul kraft ved at vælge ikonet Baseline subtraktion. Bemærk: I nogle tilfælde retraktionen kan ikke have den samme konstante kraft værdi og kurven kan vise en lineær tilt, som kan fjernes ved at vælge Offset + vippe.</li>
		<li>Definer det punkt, hvor spidsen kommer i kontakt med prøven ved at vælge ikonet Kontakt punkt beslutsomhed .</li>
		<li>Konvertere højde signal til tip-prøve adskillelse ved at vælge ikonet Tip-prøve adskillelse . Ud over at fratrække positionen kontaktpunkt, trækker denne procedure cantilever bøjning for at beregne afstanden mellem substrat overflade og AFM-tip. Bemærk: Til montering af polymer elastisk modeller, ligesom den extensible orm-lignende-forsyningskæden model og bestemmelse af interaktion længder, tip-prøve adskillelse, hvilket er korrigeret for cantilever bøjning, er nødvendig. For at bestemme styrken lastning hastighed fra hældningen på kraft-kurven og z-piezo hastighed, bør ukorrigeret kraft kurver anvendes.</li>
		<li>Screen kraft-afstanden spor for kraft toppe opstår ved brud længder over 70 nm (længden af den strakte PIND spacer)36 at udrede uspecifikke interaktioner og anvende extensible orm-lignende-kæde modellen til de markerede toppe ved at vælge den Passer en Polymer kæde Model ikon og valgte Extensible ormelignende forsyningskæden Model. Toppe i retraktion kraft kurve vil være udstyret med denne model og brud styrker og længder er opnået, sammen med de elastiske parametre af polymeren.</li>
		<li>Vis data som histogrammer viser kraft og længde-distributioner. Brug mindst 100 uforpligtende begivenheder for histogrammer.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Siden indførelsen af AFM baseret SMF'ER, det udviklede sig til en udbredt teknik til direkte sonde intra og intermolekylære kræfter af individuelle proteiner, nukleinsyrer og andre biomolekyler3,4,5. For vellykket SMF'ER eksperimenter er en passende overfladen kobling strategi en forudsætning. For at sonde intramolekylære kræfter i naturlige og syntetiske polymerer, kan polymerer være direkte koblet til substrat overflade og AFM tip36,38,39,40,41. Til undersøgelse af Inter molekylære interaktioner, såsom molekylære obligationer, men det er tilrådeligt at bruge fleksible linker molekyler såsom hetero-bifunctional PIND linkers eller polypeptidkæder, som fastgør interaktion partnere til AFM tip og den substrat overflade, for at muliggøre den korrekte orientering af de bindende partnere, at overvinde kortrækkende overflade kræfter og undgå denaturering og udfoldelsen af proteiner21,22,23, 24,25,26,27,42. Vi er derfor beskrevet en enkel og ligetil protokol for den kovalente immobilisering af proteiner via deres tilgængelige primære aminer ved hjælp af hetero-bifunctional PIND afstandsstykker.
Vi viste dens anvendelighed med undersøgelse af samspillet styrker mellem adhesin RrgA fra S. pneumoniae og ekstracellulære matrix protein Fn, som for nylig beskrevet i detaljer andetsteds13.
Den overfladekemi er veletableret og analyseret og lignende tilgange held har været anvendt i flere SMF'ER eksperimenter19,42,43,44,45. Silylether anvendes til kobling silan polymer til overfladen, er underlagt hydrolyse. Graden af hydrolyse afhænger af mængden af dannet siloxan obligationer, som kan kontrolleres under silanisering proces. Hvis høje interaktion styrker (≥ 1000 pN) forventes under SMF'ER målingerne, bør silanisering udføres via damp-fase deposition30 hvilket resulterer i dannelsen af et sammenhængende lag af hvis. Som for mange eksperimenter (fx, mange protein-protein interaktioner) er interaktion kræfter i rækken af et par hundrede pN, og proceduren beskrevet, i hvilken siloxan dannelse er udført af deposition fra en vandig fase og ubundne organo-silaner vaskes eftertænksomt med ethanol (trin 1.1.7) efterfulgt af hærdning med varme (trin 1.1.8), er tilstrækkelig.
En anden kritisk trin er at vaske den resterende EDC og NHS molekyler fra overfladen (trin 1.2.3), som rester vil føre til aktivering af carboxyl grupper på proteiner. Dette kan enten resultere i crosslinking af proteiner på den samme overflade, som kan ændre deres funktionalitet eller kovalent par aktiveret proteiner til andre proteiner på den modsatte overflade. Dette kan føre til fastspænding af proteiner mellem overfladen og AFM spids, hvilket resulterer i høje brud styrker eventuelt ledsaget af domæne udfoldning (Se figur 3b, spor 1, 4 og 5, udfoldelsen af Fn domæner)46. Det samme problem kan opstå, hvis de aktive NHS estere af PIND spacer umættede. Anbefales derfor, inkubation med Tris bufferet saltvand (trin 1.2.6), som den primære Amin af Tris slukker de resterende amino reaktive grupper.
Efter protokollen trinvis fører til en homogen fordeling af Fn på TOT silaniseret glas overflade (Se figur 2), forlader en dimerisk form af protein. Dette ligner Fn´s struktur i løsning og er i overensstemmelse med tidligere AFM data på andre prøve overflader37. Derudover opnås en passende koncentration af RrgA på AFM tip, som genererer en målværdi ~ 20% af veldefinerede interaktion begivenheder under SMF'ER målinger (figur 3 og figur 4). En anden elegant måde at kontrollere mængden af molekyler koblet til prøven substrat og cantilever tip udover varierende protein koncentration og/eller inkubation times, er kombinationen af silan-agenter med forskellige sekundære funktionelle grupper. Ved at ændre forholdet mellem protein reaktive grupper strækker sig fra PIND-polymer, kan antallet af immobiliserede proteiner være kontrolleret15,16,17,18.
Protokollen beskrevet her kan også bruges til at immobilisere andre -NH2 indeholder molekyler eller justeres til par proteiner til andre siliciumoxid overflade udover glas og silicon nitride. Afhængigt af protein designet, Amin reaktive carboxyl gruppe kan ændres til en sulfhydryl reaktive gruppe (f.eks.maleimide eller ortho-pyridyl disulfid) til par protein via dets frie-SH grupper. For Fn resulterer dette i en foruddefineret orientering13,17,20.
Sammenfattende denne protokol kan justeres for at tjene forskellige krav og er velegnet til andre biofysiske applikationer udover enkelt molekyle kraft spektroskopi eksperimenter.

Ved siden af optiske og magnetiske pincet, atomic force mikroskop (AFM)1,2 er opstået som et nyttigt værktøj til at analysere og manipulere molekyler og sonde deres egenskaber og funktioner, herunder deres reaktion på ydre kraft3 ,4. I modsætning til metoder som enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA), overflade plasmon resonans (SPR) eller kvarts krystal microbalance (QCM) opsætninger, AFM giver mulighed for at måle interaktioner på enkelt molekyle (SMF'ER)5 og enkelt celle niveau (SCFS)6 . Disse teknologier givet en værdifuld indsigt i bindende mekanismer som fange obligationer fundet for samspillet mellem E. coli pilus protein FimH med mannose7eller tandem β-lynlås gentager dannet af Fn-bindende proteiner fra S. aureus ved binding til Fn8. Vi har for nylig kunnet vise, at pilus-1 adhesin RrgA9,10 fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 er i stand til at binde til fibronektin12 med sine to terminal domæner. Dette afslørede en ny to-domæne bindende mekanisme, som adskiller sig fra tandem β-lynlås og kan aktivere piliated pneumokoktyper til at danne og vedligeholde en forbigående kontakt til fibronektin-holdige vært overflader13.
SMF'ER eksperimenter succes afhænger kritisk af funktionelle og indfødte immobilisering af biomolekyler på faste overflader og AFM tips. Som høje styrker kan forekomme under SMF'ER målinger, bør proteiner helst være kovalent koblet til overfladen. Der er et stort antal forskellige kobling metoder for immobilisering af proteiner og andre biomolekyler, samt hele celler på (uorganiske) faste overflader, nano-partikler og andre enheder, der er beskrevet i litteraturen14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Disse protokoller gør ofte brug af farlige stoffer, er vanskelige at udføre og/eller kræver særligt udstyr (f.eks., plasma renere). En enkel måde at par molekyler til glas er at vedhæfte en tykkere polymer lag af heterobifunctional overfladebehandlingsvæsker med en silan-reaktive gruppe på den ene side og en Amin-reaktive gruppe på deres anden side. Afhængigt af programmet, kobling agenter kan omfatte fleksible hydro-kulstof kæder af variabel længde, fx., polyethylenglycol (PEG). De undertrykker ikke specifikke vekselvirkninger mellem de modificerede overflader (f.eks., hydrofobe, elektrostatiske og van-der-Waals interaktioner) og kan give den koblede molekyle roterende frihed.
Her, vi beskriver en generel protokol til kovalente kobling af proteiner der indeholder en eller flere gratis amino grupper (-NH2) til glas overflader og silicon nitride AFM tips via en heterobifunctional ethoxy silan-PIND-carboxyl (-COOH). Denne protokol kan bruges i SMF'ER eksperimenter, som er eksemplificeret baseret på samspillet mellem RrgA og det ekstracellulære matrix protein Fn (Se figur 1 for en oversigt).
Det første skridt er silanisering af overflade28,29,30,31. Det drejer sig om hydrolyse af ethoxy grupper af kobling agent for at danne meget reaktive SiOH grupper. Disse kan reagere med SiOH grupper på underlaget. I en primær kondens skridt, disse silanols form brint obligationer og spredt på underlaget. I en sekundær kondensationsreaktion, (som normalt kræver varme eller vakuum for at fjerne vand), siloxan obligationer er dannet. Dette resulterer i en kovalent vedlagte organo-silan lag.
Det andet skridt er kobling af proteiner til den funktionelle (-COOH) grupper, som strækker sig fra polymer32. Først, syren er konverteret til en reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester mellemliggende, som er opnået gennem den veletablerede NHS/EDC (1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid kemi33 og gennemgår nukleofil substitution til sidst danne et AMID obligation med primære aminer på proteiner.
På denne måde RrgA var koblet til silicon nitride AFM tips og menneskelige Fn til glas substrater i en tilfældig retning og deres interaktion styrker blev analyseret på enkelt-molekyle niveau. Vores resultater viser, at den beskrevne overfladekemi fører en homogen fordeling af Fn på glasoverfladen og en passende koncentration af RrgA på spidsen, tilsyneladende af målværdien på op til 20% af interaktion begivenheder under SMF'ER målinger. Denne kemi reducerer uspecifikke baggrund interaktioner, er underlagt lille ændring under dataopsamling og egner sig derfor fortræffeligt til præcise SMF'ER eksperimenter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

I de seneste år baseret atomic force mikroskopi (AFM) enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMF'ER) udvidet vores forståelse af molekylære egenskaber og funktioner. Det gav os mulighed for at udforske en mangfoldighed af biofysiske mekanismer, f.eks., hvordan bakteriel adhesins binde til vært overflade receptorer i flere detaljer. Blandt andre faktorer afhænger succesen med SMF'ER eksperimenter den funktionelle og indfødte immobilisering af biomolekyler af interesse på faste overflader og AFM tips. Her, beskriver vi en enkel protokol til kovalente kobling af proteiner til silicium overflader ved hjælp af silan-PIND-carboxyls og det veletablerede N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) kemi i rækkefølge at udforske samspillet mellem pilus-1 adhesin RrgA fra Gram-positive bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) med ekstracellulære matrix protein fibronektin (Fn). Vores resultater viser, at den overflade functionalization fører til en homogen fordeling af Fn på glasoverfladen og til en passende koncentration af RrgA AFM cantilever spids, tilsyneladende af målværdien på op til 20% af interaktion begivenheder under SMF'ER målinger og afslørede, at RrgA binder til Fn med en gennemsnitlig styrke på 52 pN. Protokollen kan justeres til par via specifikke gratis thiol webstedsgrupper. Dette resulterer i en foruddefineret protein eller molekyle orientering og er velegnet til andre biofysiske applikationer udover SMF'ER.

Protokollen beskrevet her resultater i en kovalent immobilisering af proteiner via deres tilgængelige primære aminer med tilfældige orientering (figur 1). Figur 2 viser en AFM billede af en TOT silaniseret barometer overflade med (venstre) og uden (højre) Fn immobiliseret, registreret efter dehydrering af prøver under en svag luftstrøm af kvælstof. Silan polymer lag viser kun lille overflade corrugations med en højde af ca 2-5 nm (figur 2, højre), mens på overfladen functionalized med Fn, ca 10 nm høj Fn molekyler er tilsyneladende (figur 2, venstre). I close-ups, kan Fn dimerisk struktur genkendes. Fn molekyler synes at være kompakt med en højde på 4-5 nm ovenfor PIND overfladebehandling og en længde af ~ 120 nm (Se skær).
For at undersøge interaktion styrker af RrgA med Fn, som blev for nylig beskrevet i detaljer af vores gruppe13, var RrgA koblet til en silicon nitride AFM tip og menneskelige Fn til glas substrat (figur 3a). Figur 3 viser repræsentative tip prøve adskillelse kurver af samspillet mellem RrgA med Fn indspillet på en trække hastighed på 1 µm s-1. Den anvendte overfladekemi førte til en lav baggrunden interaktion og velformede enkelt (eller dobbelt) interaktion begivenheder (figur 3a), som var udstyret med en extensible orm som kæde (eWLC) model (røde kurver). Afbilde resultaterne af fit (ruptur kraft og -længde, se figur 4) viser, at efter at overvinde ikke-specifik overflade interaktioner mellem AFM tip og substrat og stretching PIND linkers (> 70 nm), op til ~ 19% af kraft kurver viste brud arrangementer med en gennemsnitlig brud kraft til RrgA - Fn interaktion af ~ 52 pN i et tip-prøve afstande på omkring 100 nm. I kontrast, en uanvendelig overfladekemi (her, udelades dæmper med Tris bufferet saltvand figur 3b) vil hindre en klar evaluering af enkelt interaktion begivenheder på grund af uspecifik interaktioner, flere protein bindende (spor 2 og 3) og/eller kovalente kobling af proteiner mellem prøveoverfladen og AFM cantilever tip. Dette fører til høje brud styrker (spor 1) eventuelt ledsaget af udfoldelsen af protein (Fn) domæner (spor 4 og 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figur 1: oversigt over den overfladekemi. Hydrolyse af ethoxy silan-PIND-carboxyl efterfølges af sin kondens på hydreret glasoverfladen og dannelsen af siloxan krydsbindinger. EDC reaktion med carboxyl grupper resulterer i en reaktiv o- acylisourea, mellemled Amin-reaktivt med en meget kort halveringstid i vandig opløsning (hydrolyse). Mellemliggende er stabiliseret ved dannelsen af en NHS ester, som gennemgår nukleofil substitution for at endelig danne et AMID obligation med primære aminer på proteiner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figur 2: Immobilisering af fibronektin på et glas substrat via heterobifunctional ethoxy silan PIND carboxyl kobling agent. AFM billeder af functionalized glas overflader med (venstre) og uden (ret) Fn. tal angiver individuelle Fn molekyler, som er fordelt ensartet på substrat overflade (skær). Molekylerne vedtage en dimerisk og kompakt struktur med en højde på 4-5 nm ovenfor PIND belægning og en længde på > 100 nm. Dette ligner strukturen af Fn i løsning og er i overensstemmelse med tidligere AFM data på andre overflader, fx glimmer (skalalinjen af inlays = 500 nm)37. Under AFM er billeder højde profiler langs linjerne i AFM billeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figur 3: Illustration af en SMF'ER eksperiment og repræsentant tvinge afstand kurver af RrgA - Fn interaktion. (a) RrgA og Fn var kovalent sammenkædet via heterobifunctional ethoxy silan PIND carboxyl kobling agent til en silicon nitride AFM cantilever spids og en glasoverflade, henholdsvis. Repræsentant SMFS tvinge afstand kurver opnået for RrgA - Fn interaktion med en retraktion hastighed af 1 µm s-1 med den beskrevne immobilisering af RrgA og Fn er vist. Røde kurver repræsenterer extensible ormelignende kæde passer anvendes for at opnå brud styrker og længder. Tallet er blevet ændret fra Becke, et al., ACSnano 201813. (b) repræsentant SMFS tvinge afstand kurver opnået for RrgA - Fn interaktion uden dæmper med Tris bufferet saltvand. I dette tilfælde den primære Amin af Tris var fraværende for at forblive aktive NHS estere blev efterladt umættede under eksperimentet. Dette førte til multi protein bindende (spor 2 og 3) og Fastspænding af proteiner mellem overfladen og AFM spids, hvilket resulterede i høj brud tvinger ledsaget af (Fn-) domæne udfoldelsen (spor 1, 4 og 5, Bemærk de forskellige skalaer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figur 4: kraft og længde distribution af enkelt RrgA - Fn interaktioner. Briste kraft og tilsvarende brud længde histogrammer fremstillet af RrgA - Fn SMF'ER interaktion målinger (n = 1400) på en retraktion hastighed på 1 µm s-1. Histogrammer afsløre en mest sandsynlige brud kraft fMP af 51.6 pN (Gauss passer, sort linje) og en ophobning af brud længder omkring 100 nm. Tallet er blevet ændret fra Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Denne protokol beskriver den kovalente immobilisering af proteiner med en heterobifunctional silan kobling agent til siliciumoxid overflader designet til atomic force mikroskopi baseret enkelt molekyle kraft spektroskopi som er eksemplificeret ved den samspillet mellem RrgA (pilus-1 spids adhesin af S. pneumoniae) med fibronektin.

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Medieret enzymatisk syntese og immobilisering af polymeriseret protein til enkeltmolekylet spektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro Single-Molecule Imaging Assay til analyse af cap-afhængige oversættelse kinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...