Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

TB en HG erkennen financiële steun door de Europese Onderzoeksraad "Cellufuel, geavanceerde Grant No. 294438". HCS erkent financiële steun van het ministerie voor onderwijs en onderzoek door de Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS erkent dat financiële steun van de Beierse staat ministerie van Wetenschappen en onderwijs door de focus van het onderzoek "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - galop". Wij danken Conny Hasselberg-Christoph en Martina Hörig voor technische ondersteuning

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sinds de invoering van de AFM op basis van de SBF, het uitgegroeid tot een veel gebruikte techniek om direct sonde intra en intermoleculaire krachten van de individuele eiwitten, nucleïnezuren en andere biomoleculen3,4,5. Voor succesvolle experimenten van de SBF is een passende oppervlak koppeling strategie een voorwaarde. Om de sonde de intramoleculaire krachten in natuurlijke en synthetische polymeren, kunnen de polymeren rechtstreeks worden gekoppeld aan het substraat oppervlak en de AFM tip36,38,39,40,41. Voor het onderzoek van Inter moleculaire interacties, zoals de moleculaire obligaties, het is echter raadzaam om het gebruik van flexibele linker moleculen zoals hetero-bifunctionele PEG linkers of polypeptide kettingen, hechten de interactie-partners aan het uiteinde van de AFM en de substraat oppervlak, zodat de correcte oriëntatie van de bindende-partners, te korte afstand oppervlaktekrachten overwinnen en denaturatie en ontplooiing van eiwitten21,22,23, te vermijden 24,25,26,27,42. We beschreven daarom een eenvoudig en ongecompliceerd protocol voor de covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met hetero-bifunctionele PEG afstandhouders.
We toonden de toepasbaarheid ervan met het onderzoek naar de interactie tussen adhesine RrgA van S. pneumoniae en de extracellulaire matrix eiwitten Fn, zoals onlangs in detail beschreven elders13.
De oppervlakte chemie is een gevestigde en geanalyseerd en soortgelijke benaderingen zijn met succes gebruikt in meerdere SBF experimenten19,42,43,44,45. De silylether gebruikt voor het koppelen van het polymeer silane aan het oppervlak, is onderworpen aan de hydrolyse. De graad van hydrolyse is afhankelijk van de hoeveelheid gevormde siloxaan obligaties, die tijdens het silanization-proces kan worden gecontroleerd. Als hoge interactie krachten (≥ 1000 pN) verwachting tijdens de SBF metingen, moet de silanization worden uitgevoerd via damp-fase afzetting30 die in de vorming van een continue laag van siloxanen resulteert. Wat veel experimenten (bijv., veel eiwit-eiwitinteractie) zijn de krachten van de interactie in het bereik van een paar honderd pN, en de beschreven procedure, welke siloxaan vorming is uitgevoerd door afzetting van een waterige fase en unbound organo-silanes zijn zorgvuldig afgewassen met ethanol (stap 1.1.7) gevolgd door het genezen met warmte (stap 1.1.8), is voldoende.
Een andere belangrijke stap is om te wassen van de resterende EDC en NHS moleculen uit het oppervlak (stap 1.2.3), zoals restjes naar de activering van carboxylgroepen op de eiwitten leiden zal. Dit kan ofwel resultaat in crosslinking van eiwitten op hetzelfde oppervlak, waardoor hun functionaliteit kan worden gewijzigd of covalent paar eiwitten aan andere eiwitten op het tegenovergestelde oppervlak geactiveerd. Dit kan leiden tot het klemmen van de eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip, wat in hoge breuk krachten resulteert, eventueel vergezeld van domein ontvouwen (Zie Figuur 3b, spoor 1, 4 en 5, ontplooiing van Fn domeinen)46. Hetzelfde probleem kan optreden, als de actieve NHS-esters van de pin spacer onverzadigde zitten. Daarom wordt de incubatie met Tris gebufferde zoutoplossing aanbevolen (stap 1.2.6), omdat de primaire amine van Tris de resterende amino reactieve groepen lest.
Volgens het protocol stapsgewijze leidt tot een homogene verdeling van Fn op het gesilaneerde glas oppervlak (Zie Figuur 2), waardoor een dimeric vorm van het eiwit. Dit lijkt op Fn´s structuur in de oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens over andere monster oppervlakken37. Daarnaast wordt een geschikte concentratie van RrgA op het puntje van de AFM verkregen, die genereert een streefwaarde van ~ 20% van welomschreven interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen (Figuur 3 en Figuur 4). Een andere elegante manier om te bepalen welke van moleculen die zijn gekoppeld aan de steekproef substraat en cantilever tip naast variërend van de eiwit-concentratie en/of incubatie tijden, is de combinatie van silane-agenten met verschillende secundaire functionele groepen. Door het veranderen van de verhouding van eiwit reactieve groepen zich uitstrekt van de PEG-polymeer, kunnen het aantal geïmmobiliseerdet eiwitten gecontroleerde15,16,17,18.
Het protocol hier beschreven kan ook worden gebruikt om te immobiliseren andere -NH2 met moleculen of worden aangepast aan paar eiwitten aan andere siliciumoxide oppervlakte naast glas en silicium nitride. Afhankelijk van het ontwerp van de eiwitten, de reactieve carboxylgroep van amine kan worden gewijzigd in een sulfaatzuurstof reactieve groep (bijvoorbeeld, maleimide of ortho-pyridyl-disulfide) te koppelen de eiwitten via zijn vrij-SH-groepen. Voor Fn resulteert dit in een vooraf gedefinieerde oriëntatie13,17,20.
Kortom, dit protocol dienen verschillende eisen kan worden aangepast en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast enkel molecuul kracht spectroscopie experimenten.

Naast optische en magnetische pincet, de atomaire kracht Microscoop (AFM)1,2 heeft ontpopt als een nuttig instrument om te analyseren en manipuleren van moleculen en peilen naar hun eigenschappen en functies, met inbegrip van hun reactie op externe kracht3 ,4. In tegenstelling tot methoden zoals het enzym gekoppelde immunosorbent analyse (ELISA), oppervlakte plasmon resonantie (SPR) of quartz crystal microbalans (QCM) opstellingen, AFM staat voor het meten van interacties op de enkel molecuul (SBF)5 en eencellige niveau (SCF)6 . Deze technologieën leverde waardevolle inzicht in bindende mechanismen als de obligaties van de vangst gevonden voor de interactie van E. coli pilus eiwit die FimH met mannose7, of de tandem β-rits herhaalt gevormd door Fn bindende proteïnen uit S. aureus bij binding met Fn8. Konden we onlangs te tonen dat de pilus-1 adhesine RrgA9,,10 van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 vermag binden aan fibronectine12 met haar twee terminal domeinen. Dit bleek een nieuwe twee-domein bindend mechanisme dat verschilt van de tandem β-rits en piliated pneumokokken te vormen en onderhouden van een voorbijgaande contact naar fibronectine-bevattende host oppervlakken13kan inschakelen.
Het succes van de SBF experimenten is kritisch afhankelijk van de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen op vaste oppervlakken en AFM tips. Als er hoge krachten kunnen optreden tijdens de SBF metingen, moeten de eiwitten bij voorkeur worden covalent gekoppeld aan het oppervlak. Er zijn een groot aantal verschillende koppeling methoden voor de immobilisatie van eiwitten en andere biomoleculen, evenals de hele cellen op (anorganisch) vaste oppervlakken, nano-deeltjes en andere apparaten die zijn beschreven in de literatuur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Deze protocollen maken vaak gebruik van gevaarlijke stoffen, zijn moeilijk te voeren en/of het vereisen van speciale uitrusting (b.v., plasma reiniger). Een eenvoudige manier om paar moleculen tot glas is een dikkere laag van het polymeer van heterobifunctional crosslinkers met een silane-reactieve groep aan de ene kant en een amine-reactieve groep aan de andere kant hechten. Afhankelijk van de toepassing, de koppeling agenten kunnen bestaan uit flexibele hydro-koolstof ketens met een variabele lengte, bijv., polyethylenglycol (PEG). Ze onderdrukken van niet-specifieke interacties van de gemodificeerde oppervlakken (bijvoorbeeldhydrofobe, elektrostatische en interacties van-der-Waals) en de gekoppelde molecuul roterende vrijheid kunnen bieden.
Hier beschrijven we een algemeen protocol voor de covalente koppeling van eiwitten met een of meer vrije amino groepen (-NH2) naar het glazen oppervlakken en siliciumnitride AFM tips via een heterobifunctional ethoxy silane-PEG-carboxyl (-COOH). Dit protocol kan worden gebruikt in de SBF experimenten, die wordt geïllustreerd op basis van de interactie tussen RrgA en de extracellulaire matrix eiwitten Fn (Zie Figuur 1 voor een overzicht).
De eerste stap is de silanization van de oppervlakte28,29,30,31. Het gaat om de hydrolyse van de ethoxy groepen de koppelmiddel om zeer reactieve SiOH groepen vormen. Deze kunnen reageren met SiOH groepen op de drager vervagen. In een primaire condensatie stap, deze silanols formulier waterstofbruggen en verspreid over het substraat. In een secundaire condensatiereactie (die meestal vereist warmte of vacuüm om water te verwijderen), siloxaan obligaties worden gevormd. Dit resulteert in een laag covalent bijgevoegde organo-silane.
De tweede stap is de koppeling van de eiwitten aan de functionele (-COOH) groepen die uit te van de polymeer-32 breiden. Ten eerste, het zuur wordt geconverteerd naar een reactieve N-hydroxysuccinimid (NHS) ester gevorderde, die is opgedaan door de gevestigde NHS/EDC (1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid chemie33 en ondergaat nucleofiele substitutie tot slot een amide om binding te vormen met primaire amines op de eiwitten.
Op deze manier RrgA was gekoppeld aan siliciumnitride AFM tips en menselijke Fn glazen substraten in een willekeurige oriëntatie en hun interactie krachten werden geanalyseerd op het niveau van één molecuul. Onze resultaten tonen aan dat de beschreven Oppervlaktechemie tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF metingen leidt. Deze chemie vermindert aspecifieke achtergrond interacties, is weinig vrijblijvend tijdens data-acquisitie en is daarom uitermate geschikt voor nauwkeurige SBF experimenten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

In de afgelopen jaren gebaseerd atomaire kracht microscopie (AFM) enkel molecuul kracht spectroscopie (SBF) uitgebreid van ons begrip van de moleculaire eigenschappen en functies. Het gaf ons de mogelijkheid om te ontdekken een veelheid van biofysische mechanismen, bijvoorbeeldhoe bacteriële adhesines bind aan de oppervlakte receptoren host in meer detail. Onder andere factoren hangt het succes van de SBF experimenten in de functionele en de native immobilisatie van de biomoleculen van rente op vaste oppervlakken en AFM tips. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de covalente koppeling van eiwitten aan silicium oppervlakken met behulp van silane-PEG-carboxyls en de gevestigde N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemie in volgorde om te ontdekken de interactie van pilus-1 adhesine RrgA van de gram-positieve bacterie Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) met de extracellulaire matrix eiwit fibronectine (Fn). Onze resultaten tonen aan dat de oppervlakte functionalization tot een homogene verdeling van Fn op het glasoppervlak en tot een geschikte concentratie van RrgA op de AFM cantilever tip, herkenbaar door de streefwaarde van maximaal 20% van de interactie gebeurtenissen tijdens de SBF leidt metingen en geopenbaard dat RrgA aan Fn met een gemiddelde kracht van 52 pN bindt. Het protocol kan worden aangepast aan paar via specifieke gratis thiol sitegroepen. Dit resulteert in een vooraf gedefinieerde eiwit of molecuul oriëntatie en is geschikt voor andere biofysische toepassingen naast de SBF.

Het protocol beschreven hier resultaten in een covalente immobilisatie van eiwitten via hun toegankelijk primaire amines met willekeurige oriëntatie (Figuur 1). Figuur 2 toont een beeld van de AFM van een gesilaneerde glazen oppervlak met (links) en zonder (rechts) Fn geïmmobiliseerd, afgelezen na de uitdroging van de monsters onder een zachte stroom van stikstof. De silane polymeer laag toont alleen kleine oppervlakte golvingen met een hoogte van ongeveer 2-5 nm (Figuur 2, rechts), terwijl op het oppervlak matiemaatschappij met Fn, ongeveer 10 nm hoog Fn moleculen zijn herkenbaar (Figuur 2, links). In close-ups, kan de dimeric structuur van de Fn worden herkend. De Fn-moleculen lijken te zijn met een hoogte van 4-5 nm boven de oppervlaktelaag van PEG en een lengte van compacte ~ 120 nm (Zie inserts).
Om te onderzoeken van de krachten van de interactie van RrgA met Fn, die onlangs door onze fractie13in detail werd beschreven, was de RrgA gekoppeld aan een siliciumnitride AFM uiteinde en menselijke Fn op het glas-substraat (Figuur 3a). Figuur 3 toont representatieve tip monster scheiding curven van de interactie van RrgA met Fn opgenomen met een trekken snelheid van 1 µm s-1. De gebruikte oppervlakte chemie leidde tot een lage achtergrond interactie en goed gevormde enkel (of dubbel) interactie gebeurtenissen (Figuur 3a), werden uitgerust met behulp van een extensible worm als ketting (eWLC) model (rode lijnen). Uitzetten van de resultaten van de pasvorm (breuk kracht en -lengte, Zie Figuur 4) laat zien dat na het overwinnen van aspecifieke oppervlakte interacties tussen AFM tip substraat en de linkers PEG (> 70 nm), die zich uitstrekt tot ~ 19% van de kracht-curven toonde breuk evenementen met een gemiddelde breuk kracht voor de RrgA - Fn interactie van ~ 52 pN op een tip-monster afstanden van ongeveer 100 nm. In contrast, een niet toepasbaar Oppervlaktechemie (hier weggelaten blussen met Tris gebufferde zoutoplossing Figuur 3b) zal een belemmering vormen voor een duidelijke evaluatie van één interactie evenementen als gevolg van aspecifieke interacties, meerdere eiwit bindende (sporen 2 en 3) en/of covalente koppeling van eiwitten tussen het oppervlak van het monster en de AFM cantilever tip. Dit leidt tot hoge breuk krachten (spoor 1), eventueel vergezeld van de ontplooiing van het eiwit (Fn) domeinen (sporen 4 en 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figuur 1: overzicht over de Oppervlaktechemie. De hydrolyse van ethoxy silane-PEG-carboxyl wordt gevolgd door de condensatie op de gehydrateerd glasoppervlak en de vorming van crosslinks siloxaan. De reactie van EDC met de carboxylgroepen resulteert in een reactieve o- acylisourea, een amine-reactief intermediair met een extreem korte halfwaardetijd in waterige oplossing (hydrolyse). De intermediaire wordt gestabiliseerd door de vorming van een ester van de NHS die ondergaat nucleofiele substitutie om te vormen tot slot een amide-binding met primaire amines op de eiwitten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figuur 2: Immobilisatie van fibronectine op een glazen substraat via heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel. AFM beelden van matiemaatschappij glazen oppervlakken met (links) en zonder (rechts) voetnoot aantallen wijzen op individuele Fn moleculen, die zijn homogeen verdeeld over het substraat oppervlak (insert). De moleculen vast een dimeric en compacte structuur met een hoogte van 4-5 nm boven de PEG coating en een lengte van > 100 nm. Dit lijkt op de structuur van Fn in oplossing en is in overeenstemming met eerdere AFM gegevens op andere oppervlakken, bijvoorbeeld mica (schaal staaf-van-inlays = 500 nm)37. Hieronder de AFM zijn beelden hoogte profielen langs de lijnen die zijn aangegeven in de beelden van de AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figuur 3: illustratie van een SBF experiment en vertegenwoordiger dwingen afstand curven van de RrgA - Fn interactie. (a) RrgA en Fn waren covalent gekoppeld via de heterobifunctional ethoxy silane PEG carboxyl koppelmiddel aan een siliciumnitride AFM cantilever uiteinde en een glazen oppervlak, respectievelijk. Vertegenwoordiger SMFS dwingen afstand curven voor RrgA - Fn interactie met een retractie snelheid van 1 µm s-1 met de beschreven immobilisatie van RrgA en Fn verkregen worden weergegeven. Rode curven vertegenwoordigen de uitbreidbare worm-achtige ketting past toegepast om ruptuur krachten en lengtes te verkrijgen. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano 201813. (b) de vertegenwoordiger van de SMFS dwingen afstand curven verkregen voor de RrgA - Fn interactie zonder blussen met Tris gebufferde zoutoplossing. In dit geval de primaire amine van Tris afwezig was zodat de resterende actieve NHS esters bleven onverzadigde, tijdens het experiment. Dit leidde tot multi eiwit bindende (sporen 2 en 3) en de klemmen van eiwitten tussen het oppervlak en de AFM tip wat in hoge breuk resulteerde troepen begeleid door (Fn-) domein ontvouwen (spoor 1, 4 en 5; Let op de verschillende schalen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figuur 4: kracht en lengte verdeling van één RrgA - Fn interacties. Scheuren van de kracht en bijbehorende breuk lengte histogrammen verkregen RrgA - Fn SBF interactie metingen (n = 1400) met een snelheid van de intrekking van 1 µm s-1. De histogrammen onthullen een meest waarschijnlijke breuk kracht fMP van 51.6 pN (Gauss past, zwarte lijn) en een opeenstapeling van breuk lengtes ongeveer 100 nm. De figuur is gewijzigd van Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...