Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

טרה-בתים ו- HG להכיר תמיכה כספית באמצעות המועצה האירופית למחקר "Cellufuel, גרנט מתקדם מס 294438". HCS מודה תמיכה כספית ממשרד הפדרלי עבור חינוך ומחקר דרך Technofunktionale Proteine Innovationsallianz (TeFuProt), SS מודה כספי תמיכה ממשרד מדינת בוואריה מדע וחינוך דרך המוקד מחקר "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - קנטר". אנו מודים Hasselberg קוני-כריסטוף, מרטינה Hörig לתמיכה טכנית

המחברים אין לחשוף.

מאז כניסתה של AFM מבוסס SMFS, זה התפתח טכניקה בשימוש נרחב כדי לחקור ישירות אינטרה ולכוחות הבין-מולקולרי של בודדים חלבונים, חומצות גרעין אחרות4,3,מולקולות5. לניסויים SMFS מוצלח, פני השטח המתאים צימוד אסטרטגיה היא תנאי הכרחי. כדי לחקור את הכוחות התפלגות פולימרים טבעיים וסינתטיים, פולימרים עשוי להיות ישירות מצמידים את המצע השטח ואת AFM עצה36,38,39,40,41. חקירה של האינטראקציות הבין-מולקולריות, כגון המולקולארי, זאת, רצוי להשתמש גמיש מקשר מולקולות כגון הטרו-bifunctional linkers פג או שרשראות מפוליפפטיד, לצרף השותפים לאינטראקציה בין קצה AFM ו משטח המצע, כדי לאפשר הכיוון הנכון של השותפים מחייב, כדי להתגבר על כוחות משטח לטווח קצר וכדי למנוע דנטורציה של התגלגלות של חלבונים21,22,23, 24,25,26,27,42. אנחנו ולכן תיאר עבור הנייח קוולנטיות של חלבונים באמצעות פרוטוקול פשוט וגלוי שלהם אמינים העיקרי נגיש באמצעות מפרידי פג הטרו-bifunctional.
להדגים את תחולתן עם החקירה של האינטראקציה כוחות בין adhesin RrgA מ ס pneumoniae החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn, לאחרונה מתוארות בפרוטרוט במקום13.
הכימיה משטח וותיקה, גישות דומות שנותחה שימשו בהצלחה מרובים SMFS ניסויים19,42,43,44,45. Silylether המשמש צימוד הפולימר silane אל פני השטח, כפוף הידרוליזה. מידת הידרוליזה תלויה מידת siloxane נוצר חוב, אשר ניתן לשלוט בתהליך silanization. אם כוחות האינטראקציה גבוהה (≥ 1000 pN) צפויים במהלך המדידות SMFS, silanization צריך להיות שבוצעו באמצעות אדים-שלב העדות30 אשר גורמת להיווצרות של שכבה רציפה של siloxanes. לגבי ניסויים רבים (למשל, חלבונים רבים – אינטראקציות חלבון), כוחות האינטראקציה הן בטווח של כמה מאות pN, ההליך המתואר, אילו siloxane היווצרות הוא בוצע על ידי תצהיר של שלב מימית, לא מאוגדים דשן אורגני מינרלי-חשמל סיליקון בהרהור נשטף עם אתנול (שלב 1.1.7) ואחריו ריפוי עם חום (שלב 1.1.8), מספיקה.
עוד צעד קריטי לשטוף את EDC הנותרים, מולקולות NHS מספיק עמוק (שלב 1.2.3), כמו שאריות יוביל ההפעלה של קבוצות carboxyl על החלבונים. אולי זה גם התוצאה crosslinking של חלבונים על פני השטח אותו, אשר יכול לשנות את הפונקציונליות שלהם או covalently הזוג הפעיל חלבונים חלבונים אחרים על מול פני. זה עלול להוביל מחבר חובק למעקה של החלבונים בין פני השטח הטיפ AFM, דבר המתבטא כוחות להיקרע גבוהה מלווה יכול להיות על ידי תחום התגלגלות (ראה איור 3b, מעקב 1, 4 ו-5, התגלגלות של תחומים Fn)46. אותה בעיה יכולה להופיע, אם האסטרים NHS פעיל של מרווח פג נותרו רוויים. לכן, הדגירה בתמיסת טריס buffered מומלץ (שלב 1.2.6), כמו אמין העיקרי של טריס המרווה הקבוצות הנותרות תגובתי אמינו.
בעקבות פרוטוקול stepwise מוביל בהתפלגות הומוגנית של Fn על הזכוכית silanized אל פני השטח (ראה איור 2) עוזבת צורה dimeric של החלבון. זה דומה Fn´s מבנה בתמיסה, עולה בקנה אחד עם הנתונים הקודמים AFM על משטחים אחרים דוגמת37. בנוסף, הריכוז המתאים של RrgA בקצה AFM מתקבל, אשר יוצרת ערך יעד של ~ 20% של אירועים מוגדרים היטב אינטראקציה במהלך המדידות SMFS (איור 3 ו- 4 באיור). דרך אלגנטית אחרת כדי לקבוע את כמות מולקולות בשילוב בין מדגם המצע ו שלוחה קצה חוץ משתנה הפעמים ריכוז ו/או הדגירה חלבון, הוא השילוב של silane-סוכנים עם קבוצות פונקציונליות שונות משני. על-ידי שינוי היחס בין חלבון קבוצות תגובתי המשתרעת פג-פולימר, מספר חלבונים קיבוע יכול להיות מבוקר15,16,17,18.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כדי לשתק מולקולות המכילות2 אחרות -NH או להתאימם כמה חלבונים אחרים משטח סיליקון-תחמוצת חוץ ניטריד זכוכית וסיליקון. בהתאם לעיצוב חלבון, תגובתי amine הקרבוקסיל ניתן לשנות קבוצה ראקטיבית sulfhydryl (למשל, maleimide או אורתופדיה-pyridyl דיסולפידי) עד כמה את חלבון באמצעות חינם שלו – קבוצות SH. עבור Fn, התוצאה17,13,20כיוון מוגדר מראש.
לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשרת דרישות שונות ומתאים עבור יישומים biophysical אחרים מלבד מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה ניסויים.

לצד פינצטה אופטית, מגנטי,1,(AFM) מיקרוסקופ כוח אטומי2 התפתחה כלי שימושי כדי לנתח ולטפל מולקולות, לחקור את תכונותיהם ואת פונקציות, כולל את תגובתם כוח חיצוני3 ,4. לעומת שיטות כמו וזמינותו immunosorbent מקושר אנזים (אליסה), על פני השטח פלזמון תהודה (SPR) או קריסטל קוורץ microbalance (QCM) כיוונונים, AFM מאפשרת למדוד אינטראקציות על מולקולה בודדת (SMFS)5 , רמת תא בודד (SCFS)6 . טכנולוגיות אלה הניבו יקר תובנה איגוד מנגנונים כמו הקשרים לתפוס לא מצאה את האינטראקציה של e. coli pilus חלבון ש-fimh עם מנוז7או טנדם β-הרוכסן חוזר הנוצרת על-ידי Fn מחייב חלבונים מן S. aureus על איגוד Fn8. הצלחנו לאחרונה מראים את pilus-1 adhesin RrgA9,10 מן חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס' pneumoniae)11 היא היכולת לאגד fibronectin12 עם תחומים מסוף שני שלה. זה התגלה מנגנון מחייב שני-תחום חדש אשר נבדל טנדם β-הרוכסן עשוי לאפשר piliated pneumococci וכושרם משטחים של המארח קשר כדי המכילים fibronectin ארעי13.
להצלחת הניסויים SMFS תלוי באופן ביקורתי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כמו כוחות גבוהה עלולה להתרחש במהלך המדידות SMFS, החלבונים כדאי רצוי להיות covalently יחד אל פני השטח. ישנם מספר רב של שיטות צימוד שונה לאימוביליזציה של חלבונים אחרים מולקולות, וכן תאים שלמים על משטחים מוצקים (אורגניים), ננו חלקיקים והתקנים אחרים המתוארים בספרות14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. פרוטוקולים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש בחומרים מסוכנים, שקשה לבצע ו/או דורשים ציוד מיוחד (למשל, פלזמה נקי). דרך פשוטה כמה מולקולות הזכוכית היא לצרף שכבה פולימר עבה של heterobifunctional crosslinkers עם קבוצת silane-תגובתי מצד אחד לבין קבוצה אמין-תגובתי בצד השני שלהם. בהתאם ליישום, הסוכנים צימוד יכולות לכלול רשתות הידרו-פחמן גמישה באורך משתנה, למשל., polyethylenglycol (PEG). לדכא את האינטראקציות שאינם ספציפיים של משטחים שונה (למשל, הידרופוביות, אלקטרוסטטית ואינטראקציות ון-דר-Waals) והם עשויים לספק את החופש המסתובבת של מולקולה בשילוב.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כללי עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים המכילים אחד או יותר קבוצות אמינו חופשית (-NH2) על זכוכית צף, סיליקון ניטריד AFM טיפים ויה heterobifunctional ethoxy silane-פג-carboxyl (-COOH). פרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים SMFS, אשר הוא דוגמה המבוססת על האינטראקציה של RrgA ושל החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn (ראו איור 1 סקירה כללית).
השלב הראשון הוא silanization של פני השטח28,29,30,31. היא כוללת את הידרוליזה של הקבוצות ethoxy של סוכן צימוד כדי ליצור קבוצות SiOH תגובתי. אלה יכולים להגיב עם קבוצות SiOH על המצע. הריכוז העיקרי צעד, קשרי מימן טופס אלה silanols, על המצע. בתגובה התעבות משנית (אשר בדרך כלל מחייב חום או ואקום להסיר את המים), אגרות חוב siloxane נוצרות. התוצאה היא שכבה אורגניות המצורפת covalently-silane.
השלב השני הוא צימוד של החלבונים פונקציונליות (-COOH) קבוצות אשר להאריך הפולימר32. ראשית, החומצה מומר תגובתי N-hydroxysuccinimid (NHS) אסתר ביניים, אשר הושג באמצעות ומבוססת NHS/EDC (1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid כימיה33 ועוברים התמרה נוקלאופילית סוף סוף לטופס אמיד להיקשר אמינים העיקרי על החלבונים.
בדרך זו, RrgA היה בשילוב סיליקון ניטריד AFM טיפים, Fn אנושי כדי זכוכית מצעים בשנת כיוון אקראי, כוחות האינטראקציה שלהם נותחו על רמת מולקולה בודדת. התוצאות שלנו מראים כי הכימיה השטח המתואר מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על הטיפ, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך המדידות SMFS. כימיה זו מפחיתה את האינטראקציות שאינם ספציפיים רקע רלבנטי קטן במהלך איסוף הנתונים, ולכן מתאימה מצוין לניסויים SMFS מדויק.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

בשנים האחרונות, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבוסס מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה (SMFS) להרחיב את ההבנה שלנו של תכונות מולקולאריות ופונקציות. זה נתן לנו הזדמנות לגלות את ריבוי של מנגנונים biophysical, למשל, adhesins איך חיידקי, לאגד מארח קולטנים משטח בפירוט רב יותר. בין היתר, ההצלחה של ניסויים SMFS תלוי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות ריבית על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים סיליקון משטחים באמצעות silane-פג-carboxyls והכימיה N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ומבוססת על מנת כדי לחקור את האינטראקציה של pilus-1 adhesin RrgA חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס' pneumoniae) עם fibronectin חלבון (Fn) מטריצה חוץ-תאית. התוצאות שלנו להראות כי functionalization פני השטח מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על קצה זיז AFM, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך SMFS מדידות חשף כי RrgA נקשר Fn עם כוח רשע של 52 pN. ניתן לכוונן את הפרוטוקול הזוג באמצעות קבוצות אתר ספציפי תיול חינם. זו התוצאה כיוון חלבון או מולקולה מראש והיא מתאים ליישומי biophysical אחרים מלבד SMFS.

הפרוטוקול המתוארים כאן תוצאות קיבעון קוולנטיות של חלבונים באמצעות שלהם אמינים העיקרי נגיש עם אוריינטציה אקראי (איור 1). איור 2 מציג תמונה AFM של משטח זכוכית silanized עם (משמאל) והקליט ללא Fn (מימין) משותק, לאחר להתייבשות של הדגימות תחת זרם עדין של חנקן. השכבה פולימר silane מראה רק קטן משטח corrugations בגובה של 2-5 nm (איור 2, נכון), ואילו על פני השטח functionalized עם Fn, כ 10 nm גבוהה Fn מולקולות הן לכאורה (איור 2, משמאל). ב צילומי תקריב, ניתן לזהות את המבנה dimeric של Fn. מולקולות Fn. נראה קומפקטי לגובה של 4-5 nm מעל הציפוי משטח פג, באורך של ~ 120 ננומטר (ראה מוסיף).
כדי לחקור את כוחות האינטראקציה של RrgA עם Fn, אשר לאחרונה תוארה בפירוט על ידי שלנו קבוצה13, RrgA היה בשילוב סיליקון ניטריד AFM עצה ו Fn האנושית אל המצע זכוכית (איור 3 א). איור 3 מראה עצה נציג מדגם עקומות ההפרדה של אינטראקציה RrgA עם Fn הקליט במהירות מושך של מיקרומטר 1 s-1. הכימיה משטח בשימוש הוביל אינטראקציה עם רקע נמוך ואירועים דמויי אינטראקציה בודדת (או זוגי) (איור 3 א), אשר היו מצוידים באמצעות של תולעת להרחבה כמו מודל שרשרת (eWLC) (אדום ' עקומות '). התוויית התוצאות של התאים (קרע כוח ואורך, ראה איור 4) מראה כי לאחר התגברות על אינטראקציות משטח שאינם ספציפיים בין עצה AFM ו המצע, מתיחה של linkers פג (> 70 ננומטר), עד ~ 19% של עקומות כוח הראתה קרע אירועים עם קרע מתכוון לכפות על RrgA - Fn האינטראקציה של ~ pN 52 במרחקים עצה-דוגמה של 100 ננומטר. לעומת זאת, כימיה פני השטח המיותר (כאן, הושמט שכבתה עם טריס נאגר מלוחים איור 3b) יפריע הערכה ברורה של אינטראקציה בודדת אירועים בגלל אינטראקציות לא ספציפי, חלבון מרובים מחייב (trace 2 ו-3) ו/או צימוד קוולנטיות של חלבונים בין פני השטח דוגמת קצה זיז AFM. זה מוביל לכוחות להיקרע גבוהה (trace 1) יכול להיות מלווה התגלגלות של חלבון (Fn) קבוצות המחשבים (trace 4 ו- 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> איור 1: סקירה על פני השטח הכימיה. הידרוליזה של ethoxy silane-פג-carboxyl ואחריו שלה עיבוי על משטח זכוכית hydrated ואת היווצרות siloxane crosslinks. התגובה של EDC עם קבוצות carboxyl תוצאות תגובתי o- acylisourea, ביניים אמין-תגובתי עם מחצית חיים מאוד קצר בתמיסה המימית (הידרוליזה). הביניים מיוצב על ידי היווצרות של אסתר NHS אשר עובר התמרה נוקלאופילית להקים סוף סוף של בונד אמיד עם ראשי אמינים על החלבונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> איור 2: קיבעון של fibronectin על זכוכית המצע ויה heterobifunctional ethoxy silane פג carboxyl צימוד הסוכן. AFM תמונות של זכוכית functionalized צף עם (משמאל), בלי (מימין) Fn. המספרים מציינים מולקולות Fn בודדים, אשר מופצים homogeneously על פני המצע (מוסיף). המולקולות לאמץ מבנה dimeric, קומפקטי בגובה של 4-5 nm מעל המקל ציפוי והאורך > 100 ננומטר. זה דומה למבנה Fn בתמיסה, עולה בקנה אחד עם הנתונים הקודמים AFM על משטחים אחרים, למשל, נציץ (סרגל קנה מידה של אינליי = 500 ננומטר)37. AFM תמונות להלן גובה פרופילים לאורך הקווים המצוין של AFM תמונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> איור 3: איור של הניסוי SMFS וכן נציג כוח עקומות מרחק של RrgA - Fn אינטראקציה. (א) RrgA, Fn היו מקושרים covalently דרך silane ethoxy heterobifunctional פג carboxyl צימוד הסוכן כדי ניטריד הסיליקון AFM זיז עצה, משטח זכוכית, בהתאמה. נציג SMFS בכוח מרחק עקומות השיג עבור RrgA - האינטראקציה Fn במהירות הכחשה של s 1 מיקרומטר-1 עם הנייח תיאר RrgA ו Fn מוצגים. עקומות אדומים מייצגים את שרשרת תולעת להרחבה. מתאים מיושם כדי להשיג כוחות קרע אורכי. האיור השתנה Becke, et al., ACSnano 201813. (ב) SMFS נציג כוח עקומות מרחק שהושג עבור RrgA - Fn אינטראקציה ללא שכבתה עם טריס buffered מלוחים. במקרה זה, נעדר אמין העיקרי של טריס כך שנותרו פעילים NHS אסטרים נותרו רוויה במהלך הניסוי. זה הוביל רב חלבון מחייב (trace 2 ו- 3), לבצע את חסימת העורקים של חלבונים בין פני השטח בקצה AFM אשר הביא להיקרע גבוהה כוחות תחום מלווה (Fn-) התגלגלות (trace 1, 4 ו- 5; הערה על סולמות שונים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> איור 4: חלוקת כוח ואורך RrgA יחיד - Fn אינטראקציות. קרע כוח, המתאימים היסטוגרמות אורך של קרע, המתקבל RrgA - Fn SMFS אינטראקציה מדידות (n = 1400) במהירות הכחשה של s 1 מיקרומטר-1. היסטוגרמות לחשוף הסביר ביותר קרע כוח fMP של 51.6 pN (גאוס להתאים, קו שחור) ואת הצטברות של קרע אורכי סביב 100 ננומטר. האיור השתנה מ Becke, 2018. et al., ACSnano,13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...