Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
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टीबी और पारा यूरोपीय अनुसंधान परिषद "Cellufuel, उंनत अनुदान No. २९४४३८" के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । HCS Innovationsallianz Technofunktionale प्रोटीन (TeFuProt) के माध्यम से शिक्षा और अनुसंधान के लिए संघीय मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है, एसएस विज्ञान और शिक्षा के लिए Bavarian राज्य मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार शोध फोकस के माध्यम से "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-खिचड़ी" । तकनीकी समर्थन के लिए हम आनाकानी Hasselberg-क्रिस्टोफ और मार्टिना Hörig को धन्यवाद

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

AFM आधारित SMFS की शुरूआत के बाद से, यह एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक में विकसित करने के लिए सीधे व्यक्तिगत प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अंय अणुओं3,4,5के इंट्रा और आणविक बलों की जांच । सफल SMFS प्रयोगों के लिए, एक उपयुक्त सतह युग्मन रणनीति एक शर्त है । प्राकृतिक और सिंथेटिक पॉलिमर में intramolecular बलों की जांच करने के लिए, पॉलिमर सीधे सब्सट्रेट सतह और AFM टिप३६,३८,३९,४०,४१करने के लिए युग्मित किया जा सकता है । इस तरह के आणविक बांड के रूप में अंतर-आणविक बातचीत, की जांच के लिए, तथापि, यह सलाह दी जाती है कि ऐसे hetero-bifunctional खूंटी लिंकर्स, या पॉलीपेप्टाइड जंजीरों के रूप में लचीला linker अणुओं का उपयोग करने के लिए AFM टिप और बातचीत भागीदारों संलग्न करने के लिए सब्सट्रेट सतह, आदेश में बाध्यकारी भागीदारों के सही अभिविन्यास के लिए अनुमति देने के लिए, कम दूरी की सतह बलों को दूर करने के लिए और विकार से बचने के लिए और प्रोटीन का खुलासा21,22,23, 24,25,26,27,४२. इसलिए हम hetero-bifunctional खूंटी स्पेसिंग का उपयोग कर अपने सुलभ प्राथमिक अमीन के माध्यम से प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण के लिए एक सरल और सीधे आगे प्रोटोकॉल का वर्णन किया ।
हम एस निमोनिया और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन से adhesin RrgA के बीच बातचीत बलों की जांच के साथ अपनी प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया, के रूप में हाल ही में विस्तार में वर्णित13कहीं ।
भूतल रसायन विज्ञान अच्छी तरह से स्थापित है और विश्लेषण किया गया है और इसी तरह के दृष्टिकोण सफलतापूर्वक एकाधिक SMFS प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है19,४२,४३,४४,४५. silylether सतह के लिए silane बहुलक युग्मन के लिए इस्तेमाल किया, hydrolysis के अधीन है । hydrolysis की डिग्री का गठन siloxane बांड की राशि पर निर्भर करता है, जो silanization प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जा सकता है । यदि उच्च संपर्क बलों (≥ १००० pN) SMFS मापन के दौरान की उंमीद कर रहे हैं, silanization भाप के माध्यम से किया जाना चाहिए चरण30 बयान जो siloxanes की एक सतत परत के गठन में परिणाम । कई प्रयोगों के लिए के रूप में (जैसे, कई प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत), संपर्क बलों कुछ सौ pN की सीमा में हैं, और वर्णित प्रक्रिया, जिसमें siloxane गठन एक जलीय चरण और असीम से जमाव से बाहर किया जाता है organo-silanes सोच से इथेनॉल (कदम 1.1.7) गर्मी (कदम 1.1.8) के साथ इलाज के बाद के साथ धोया जाता है, पर्याप्त है ।
एक और महत्वपूर्ण कदम शेष EDC और (1.2.3 कदम) सतह से एन एच एस अणुओं को धो रहा है, के रूप में बचे प्रोटीन पर carboxyl समूहों के सक्रियण के लिए नेतृत्व करेंगे । यह या तो एक ही सतह पर प्रोटीन के crosslinking में परिणाम हो सकता है, जो उनकी कार्यक्षमता या covalently जोड़े को विपरीत सतह पर अंय प्रोटीन के लिए प्रोटीन सक्रिय बदल सकते हैं । यह सतह और AFM टिप है, जो उच्च टूटना बलों में परिणाम संभवतः डोमेन खुलासा के साथ के बीच प्रोटीन की clamping के लिए नेतृत्व कर सकते है (चित्र 3 बी, ट्रेस 1, 4 और 5, एफ एन डोमेन का खुलासा)४६। एक ही समस्या हो सकती है, अगर खूंटी स्पेसर के सक्रिय एन एच एस एस्टर संतृप्त छोड़ दिया जाता है । इसलिए, Tris के साथ मशीन खारा बफर की सिफारिश की है (1.2.6 कदम), Tris के प्राथमिक अमीन के रूप में शेष अमीनो प्रतिक्रियाशील समूहों बुझती है ।
प्रोटोकॉल stepwise के बाद silanized ग्लास सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है ( चित्रा 2देखें), प्रोटीन का एक dimeric रूप छोड़ने । इस समाधान में एफ एन ´ एस संरचना जैसा दिखता है और अंय नमूना३७सतहों पर पिछले AFM डेटा के अनुरूप है । इसके अलावा, AFM टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता प्राप्त की है, जो SMFS माप के दौरान अच्छी तरह से परिभाषित बातचीत की घटनाओं के ~ 20% का एक लक्ष्य मूल्य उत्पंन करता है (चित्रा 3 और चित्रा 4) । एक और सुरुचिपूर्ण तरीका है प्रोटीन एकाग्रता और/या गर्मी के समय अलग करने के अलावा नमूना सब्सट्रेट और ब्रैकट टिप करने के लिए युग्मित अणुओं की राशि को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न माध्यमिक कार्यात्मक समूहों के साथ silane-एजेंटों का संयोजन है । खूंटी-पॉलिमर से विस्तार करने वाले प्रोटीन रिएक्टिव समूहों का अनुपात बदलकर, मैटीरियल प्रोटीन की संख्या15,16,17,18नियंत्रित की जा सकती है ।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य-एनएच2 अणुओं से युक्त या कांच और सिलिकॉन नाइट्राइड के अलावा अन्य सिलिकॉन ऑक्साइड सतह के लिए कुछ प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन डिजाइन के आधार पर, अमीन प्रतिक्रियाशील carboxyl समूह एक sulfhydryl प्रतिक्रियाशील समूह (जैसे, maleimide या ऑर्थो-pyridyl डाइसल्फ़ाइड) के लिए अपने मुक्त-एसएच समूहों के माध्यम से प्रोटीन दंपति को बदला जा सकता है । एफ एन के लिए, एक पूर्वनिर्धारित अभिविंयास13,17,20में यह परिणाम है ।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन आवश्यकताओं की सेवा समायोजित किया जा सकता है और एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।

ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी के बगल में, परमाणु बल माइक्रोस्कोप (AFM)1,2 एक उपयोगी उपकरण के रूप में उभरा है विश्लेषण और अणुओं में हेरफेर और उनके गुण और कार्य, बाहरी बल 3 के लिए अपनी प्रतिक्रिया सहित उनकी जांच ,4. एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा), सतह plasmon अनुनाद (SPR) या क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance (QCM) setups जैसे तरीकों के विपरीत, AFM एकल अणु (SMFS)5 और एकल कोशिका स्तर (SCFS) 6 पर बातचीत को मापने के लिए अनुमति देता है . इन प्रौद्योगिकियों पकड़ बांड की तरह बाध्यकारी तंत्र में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि उपज ई. कोलाई pilus प्रोटीन FimH mannose के साथ7, या मिलकर β-जिपर एस aureus से एफ एन बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा गठित दोहराता के साथ बातचीत के लिए मिला 8एफ एन के लिए बाध्यकारी पर । हम हाल ही में यह दिखाने में सक्षम थे कि pilus-1 adhesin RrgA9,10 ग्राम से पॉजिटिव जीवाणु स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (S. निमोनिया)11 को fibronectin12 में बांध कर अपने दो टर्मिनल डोमेन के साथ । यह एक नया दो डोमेन बाइंडिंग प्रणाली है जो मिलकर β-जिपर से अलग है और piliated pneumococci सक्षम करने के लिए फार्म और fibronectin युक्त मेजबान13सतहों के लिए एक क्षणिक संपर्क बनाए रखने के लिए कर सकते है पता चला ।
SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर कार्यात्मक और गैर-अणुओं के देशी स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । के रूप में उच्च बलों SMFS माप के दौरान हो सकता है, प्रोटीन अधिमानतः सतह के लिए युग्मित किया जाना चाहिए covalently । वहां प्रोटीन और अंय जैव अणुओं के स्थिरीकरण के लिए विभिंन युग्मन तरीकों की एक बड़ी संख्या में हैं, साथ ही साथ पूरी कोशिकाओं पर (अकार्बनिक) ठोस सतहों, नैनो कणों और अंय साहित्य में वर्णित उपकरणों14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. इन प्रोटोकॉल अक्सर खतरनाक पदार्थों का उपयोग करने के लिए, प्रदर्शन और/या विशेष उपकरण (जैसे, प्लाज्मा क्लीनर) की आवश्यकता है मुश्किल कर रहे हैं । कांच के लिए कुछ अणुओं के लिए एक सरल तरीका है एक तरफ एक silane-प्रतिक्रियाशील समूह और उनके दूसरे पक्ष पर एक अमीन-प्रतिक्रियाशील समूह के साथ heterobifunctional crosslinkers का एक मोटा बहुलक परत संलग्न है । आवेदन पर निर्भर करता है, युग्मन एजेंटों लचीला हाइड्रो चर लंबाई के कार्बन श्रृंखला, जैसे, polyethylenglycol (खूंटी) शामिल कर सकते हैं । वे संशोधित सतहों के गैर विशिष्ट बातचीत को दबाने (जैसे, hydrophobic, इलेक्ट्रोस्टैटिक और वान-डेर-Waals बातचीत) और युग्मित अणु रोटेशन स्वतंत्रता प्रदान कर सकते हैं ।
यहां, हम एक या एक से अधिक मुक्त अमीनो समूहों (-NH2) युक्त प्रोटीन की आबंध युग्मन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल का वर्णन कांच सतहों और सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां एक heterobifunctional ethoxy silane-खूंटी-carboxyl (-COOH) के माध्यम से । इस प्रोटोकॉल SMFS प्रयोगों, जो RrgA और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन के संपर्क के आधार पर उदाहरण है में इस्तेमाल किया जा सकता है (एक सिंहावलोकन के लिए 1 चित्र देखें) ।
पहला कदम सतह28,29,30,31के silanization है । यह युग्मन एजेंट के ethoxy समूहों के hydrolysis के क्रम में उच्च प्रतिक्रियाशील SiOH समूहों के रूप में शामिल है । इन सब्सट्रेट पर SiOH समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । एक प्राथमिक संघनित्र कदम में, इन silanols फार्म हाइड्रोजन बांड और सब्सट्रेट पर फैल गया । एक माध्यमिक संघनित्र प्रतिक्रिया में (जो आम तौर पर गर्मी या निर्वात के लिए पानी निकालने की आवश्यकता है), siloxane बांड का गठन कर रहे हैं । यह एक covalently संलग्न organo-silane परत में परिणाम है ।
दूसरे चरण कार्यात्मक (-COOH) समूहों जो बहुलक३२से विस्तार करने के लिए प्रोटीन के युग्मन है । सबसे पहले, एसिड एक प्रतिक्रियाशील N-hydroxysuccinimid (एन एच एस) एस्टर मध्यवर्ती, जो अच्छी तरह से स्थापित एन एस सी के माध्यम से प्राप्त की है (1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid रसायन विज्ञान३३ और बहोत nucleophilic प्रतिस्थापन करने के लिए परिवर्तित हो जाता है अंत में प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के साथ एक के बीच संबंध बनाने के लिए ।
इस तरह, RrgA एक यादृच्छिक अभिविंयास में सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां और ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए मानव एफ एन के लिए युग्मित किया गया था और उनके संपर्क बलों एकल अणु स्तर पर विश्लेषण किया गया । हमारे परिणाम बताते है कि वर्णित सतह रसायन विज्ञान के कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS माप के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट है । इस रसायन विज्ञान गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बातचीत कम कर देता है, डेटा अधिग्रहण के दौरान थोड़ा परिवर्तन के अधीन है और इसलिए उत्कृष्ट सटीक SMFS प्रयोगों के लिए अनुकूल है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

हाल के वर्षों में, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS) आणविक संपत्तियों और कार्यों की हमारी समझ को बढ़ाया. यह हमें करने के लिए एक भौतिक तंत्र की बहुलता का पता लगाने का अवसर दिया, जैसे, कैसे बैक्टीरियल adhesins और अधिक विस्तार में सतह रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए बाध्य । अंय कारकों के अलावा, SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर ब्याज की कार्यात्मक और देशी के स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । यहां, हम सिलिकॉन के लिए प्रोटीन का आबंध युग्मन के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन silane-खूंटी-carboxyls और अच्छी तरह से स्थापित N-hydroxysuccinimid/1-एथिल-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimid (EDC/ स्ट्रेप्टोकोकस मैट्रिक्स प्रोटीन extracellular (एफ एन) के साथ ग्राम पॉजिटिव जीवाणु fibronectin निमोनिया (एस निमोनिया) से pilus-1 adhesin RrgA की बातचीत का पता लगाने के लिए । हमारे परिणाम बताते है कि सतह functionalization कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और AFM ब्रैकट टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट माप और पता चला कि RrgA बांध ५२ pN का मतलब बल के साथ एफ एन के लिए । प्रोटोकॉल साइट विशिष्ट मुक्त thiol समूहों के माध्यम से जोड़े को समायोजित किया जा सकता है । एक पूर्वनिर्धारित प्रोटीन या अणु अभिविंयास में यह परिणाम है और SMFS के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।

प्रोटोकॉल यादृच्छिक अभिविंयास (चित्रा 1) के साथ उनके सुलभ प्राथमिक अमीन के माध्यम से प्रोटीन के एक आबंध स्थिरीकरण में यहां परिणाम वर्णित है । चित्रा 2 के साथ एक silanized कांच की सतह के एक AFM छवि से पता चलता है (बाएं) और बिना (सही) एफ एन मैटीरियल, नाइट्रोजन की एक सौंय धारा के तहत नमूनों की निर्जलीकरण के बाद दर्ज की गई । silane बहुलक परत लगभग 2-5 एनएम की ऊंचाई के साथ केवल छोटे सतह नालीदार दिखाता है (2 चित्रा, सही), जबकि एफ एन के साथ कार्यात्मक सतह पर, लगभग 10 एनएम उच्च एफ एन अणुओं स्पष्ट (चित्रा 2, बाएं) हैं । बंद अप में, एफ एन के dimeric संरचना पहचाना जा सकता है । एफ एन अणु को खूंटी सतह कोटिंग के ऊपर 4-5 एनएम की ऊंचाई और ~ १२० एनएम की लंबाई के साथ कॉंपैक्ट होने लगते है (आवेषण देखें) ।
एफ एन, जो हाल ही में हमारे13समूह द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया था के साथ RrgA के संपर्क बलों की जांच करने के लिए, RrgA एक सिलिकॉन नाइट्राइड AFM टिप और ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए मानव एफ एन के लिए युग्मित था (3 ए आंकड़ा) । 1 µm के एक खींच वेग पर दर्ज एफ एन के साथ RrgA की बातचीत के प्रतिनिधि टिप नमूना जुदाई घटता से पता चलताहै 3 चित्रा . प्रयुक्त सतह रसायन विज्ञान एक कम पृष्ठभूमि बातचीत और अच्छी तरह के आकार का एक (या डबल) बातचीत की घटनाओं (3ए), जो श्रृंखला की तरह एक एक्सटेंसिबल कीड़ा (eWLC) मॉडल (लाल curves) का उपयोग फिट थे के लिए नेतृत्व किया । फिट के परिणामों की साजिश रचने (टूटना बल और लंबाई, देखें चित्रा 4) AFM टिप और सब्सट्रेट के बीच गैर विशिष्ट सतह बातचीत पर काबू पाने के बाद पता चलता है कि, और खूंटी linkers खींच (> ७० एनएम), अप करने के लिए ~ 19% के बल curves टूटना दिखाया RrgA के लिए एक मतलब टूटना बल के साथ घटनाक्रम-एक टिप पर ~ ५२ pN के एफ एन बातचीत के बारे में १०० एनएम का नमूना दूरी । इसके विपरीत, एक लागू सतह रसायन विज्ञान (यहां, Tris बफर खारा आंकड़ा 3 बीके साथ शमन लोप) एकल बातचीत की घटनाओं के कारण एक स्पष्ट मूल्यांकन बाधा होगी विशिष्ट बातचीत के लिए, एकाधिक प्रोटीन बाध्यकारी (ट्रेस 2 और 3) और/ आबंध नमूना सतह और AFM ब्रैकट टिप के बीच प्रोटीन के युग्मन । यह उच्च टूटना बलों की ओर जाता है (1 ट्रेस) संभवतः प्रोटीन का खुलासा (एफ एन) डोमेन (4 और 5 का पता लगाने के साथ) ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> चित्रा 1: भूतल रसायन विज्ञान पर सिंहावलोकन । ethoxy silane-खूंटी-carboxyl के hydrolysis हाइड्रेटेड कांच की सतह पर इसके संघनित्र और siloxane crosslinks के गठन के बाद है । carboxyl समूहों के साथ EDC की प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील हे-acylisourea, एक अमीन-प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती जलीय समाधान (hydrolysis) में एक अत्यंत कम आधा जीवन के साथ परिणाम है । मध्यवर्ती एक एन एच एस एस्टर जो nucleophilic प्रतिस्थापन के लिए अंत में प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के साथ एक संबंध के रूप में फार्म के गठन से स्थिर है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> चित्रा 2: heterobifunctional ethoxy silane खूंटी carboxyl युग्मन एजेंट के माध्यम से एक गिलास सब्सट्रेट पर fibronectin के स्थिरीकरण. कार्यात्मक कांच की AFM छवियों के साथ सतहों (बाएं) और बिना (दाएं) एफ एन. संख्या व्यक्तिगत एफ एन अणु, जो सब्सट्रेट सतह (आवेषण) पर वितरित homogeneously है संकेत मिलता है । अणुओं खूंटी कोटिंग और > 100 एनएम की लंबाई के ऊपर 4-5 एनएम की ऊंचाई के साथ एक dimeric और कॉंपैक्ट संरचना को अपनाने । यह समाधान में एफ एन की संरचना जैसा दिखता है और अंय सतहों पर पिछले AFM डेटा के अनुरूप है, जैसे, अभ्रक (inlays के पैमाने बार = ५०० एनएम)३७। नीचे AFM छवियों AFM छवियों में संकेत दिया लाइनों के साथ ऊंचाई प्रोफाइल हैं । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> चित्रा 3: एक SMFS प्रयोग और प्रतिनिधि बल दूरी RrgA-एफ एन बातचीत के curves का चित्रण । (क) RrgA और एफ एन covalently एक सिलिकॉन silane carboxyl नाइट्राइड टिप और एक गिलास सतह, क्रमशः के लिए heterobifunctional ethoxy AFM खूंटी ब्रैकट युग्मन एजेंट के माध्यम से जुड़े थे । प्रतिनिधि SMFS बल दूरी RrgA के लिए प्राप्त-1 µm एस के एक कर्षण वेग में एफ एन बातचीत RrgA और एफ एन के साथ वर्णित स्थिरीकरण दिखाया जाता है । लाल curves एक्सटेंसिबल वर्म की तरह श्रृंखला टूटना बलों और लंबाई प्राप्त करने के लिए लागू फिट बैठता है प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा बेक, एट अल., ACSnano २०१८13से संशोधित किया गया है । (ख) प्रतिनिधि SMFS बल दूरी curves Tris के साथ शमन के बिना RrgA-एफ एन बातचीत के लिए प्राप्त किया । इस मामले में, Tris के प्राथमिक अमीन तो अनुपस्थित था कि शेष सक्रिय एन एच एस एस्टर प्रयोग के दौरान संतृप्त छोड़ दिया गया । यह बहु प्रोटीन बाध्यकारी करने के लिए नेतृत्व (2 और 3 ट्रेस) और सतह और AFM टिप के बीच प्रोटीन की clamping जो उच्च टूटना बलों के परिणामस्वरूप के साथ (एफ एन-) डोमेन खुलासा (ट्रेस 1, 4 और 5; अलग तराजू नोट) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> चित्रा 4: बल और एकल RrgA की लंबाई वितरण-एफ एन बातचीत । टूटना बल और इसी टूटना लंबाई RrgA-एफ एन SMFS संपर्क मापन (n = १४००) से प्राप्त हिस्टोग्राम 1 µm एस-1के एक कर्षण वेग पर । हिस्टोग्राम एक सबसे संभावित टूटना बल एफ ५१.६ pN केसांसद (गॉस फ़िट, काली रेखा) और १०० एनएम के आसपास टूटना लंबाई का एक संचय प्रकट करते हैं । यह आंकड़ा बेक, एट अल., ACSnano, २०१८13से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

इस प्रोटोकॉल सिलिकॉन के लिए एक heterobifunctional silane युग्मन एजेंट के साथ प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण का वर्णन-ऑक्साइड सतहों परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए डिज़ाइन किया गया है जो द्वारा उदाहरण है fibronectin के साथ RrgA ( एस. निमोनिया के pilus-1 टिप adhesin) की बातचीत ।

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

बायोमोलेस्क्यू संरचना निर्धारण के लिए एकल अणु स्तर पर उच्च शुद्धता FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

जी के एकल अणु हेरफेर-चुंबकीय चिमटी द्वारा quadruplexes

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

एकल अणु ट्रैकिंग माइक्रोस्कोपी - Cytosolic अणु के विविध राज्यों का निर्धारण करने के लिए एक उपकरण

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-मध्यस्थता एंजाइमैटिक संश्लेषण और एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए बहुलक प्रोटीन के Immobilization

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

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कैप-डिपेंडेंट ट्रांसल काइनेटिक्स के विश्लेषण के लिए इन विट्रो सिंगल-अणु इमेजिंग परख

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...