Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
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TB e HG riconosce un sostegno finanziario attraverso il Consiglio europeo della ricerca "Cellufuel, Advanced Grant n. 294438". HCS riconosce il sostegno finanziario del Ministero federale per formazione e ricerca attraverso le Proteine di Technofunktionale di Innovationsallianz (TeFuProt), SS riconosce finanziari di sostegno dal Ministero bavarese per scienza ed educazione attraverso il focus della ricerca "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Ringraziamo Conny Hasselberg-Christoph e Martina Hörig per supporto tecnico

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Poiché l'introduzione del AFM basato SMF, si è evoluto in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente intra e forze intermolecolari di singole proteine, acidi nucleici e altre biomolecole3,4,5. Per esperimenti riusciti di SMF, una superficie appropriata strategia di accoppiamento è un prerequisito. Per sondare le forze intramolecolari in polimeri naturali e sintetici, i polimeri possono essere accoppiati direttamente alla superficie del substrato e AFM punta36,38,39,40,41. Per l'indagine sulle interazioni inter-molecolari, quali legami molecolari, tuttavia, si consiglia di utilizzare molecole linker flessibile come etero-bifunzionale PEG linker, o catene polipeptidiche, per collegare i partner di interazione alla punta dell'AFM e la superficie del substrato, al fine di consentire il corretto orientamento dei partner di legame, per superare le forze di superficie a corto raggio e per evitare la denaturazione e svolgersi delle proteine21,22,23, 24,25,26,27,42. Abbiamo pertanto descritto un protocollo semplice e dritto in avanti per l'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro ammine primarie accessibile tramite etero-bifunzionale PEG distanziali.
Abbiamo dimostrato la sua applicabilità con l'indagine dell'interazione delle forze tra adesina RrgA da S. pneumoniae e la proteina della matrice extracellulare Fn, come recentemente descritto dettagliatamente altrove13.
La chimica di superficie è ben consolidata e approcci analizzati e simili sono stati utilizzati con successo in molteplici funzioni SMF esperimenti19,42,43,44,45. Il silylether utilizzato per accoppiare il polimero silano sulla superficie, è soggetto a idrolisi. Il grado di idrolisi dipende dalla quantità di legami silossanici formata, che può essere controllato durante il processo di silanizzazione. Se forze di interazione elevate (≥ 1000 pN) sono attesi durante le misurazioni di SMF, la silanizzazione dovrebbe essere eseguita tramite deposizione di vapore-fase30 che provoca la formazione di uno strato continuo di silossani. Per quanto riguarda molti esperimenti (ad esempio, molte proteine – interazioni della proteina), le forze di interazione sono nel range di pochi centinaia pN e la procedura descritta, in quale silossano formazione è effettuato dalla deposizione da una fase acquosa e non associati organo-silani minuziosamente vengono lavati via con etanolo (punto 1.1.7) seguita da trattamento con calore (passaggio 1.1.8), è sufficienti.
Un altro passo fondamentale è quello di lavare il restante EDC e molecole di NHS fuori la superficie (punto 1.2.3), come gli avanzi porterà all'attivazione di gruppi carbossilici sulle proteine. Questo può sia risultato in reticolazione delle proteine sulla superficie stessa, che può alterare la loro funzionalità o covalenza coppia attivato proteine ad altre proteine sulla superficie opposta. Questo può portare a delle proteine tra la superficie e la punta AFM, che si traduce in alta rottura forze eventualmente accompagnate dal dominio dispiegarsi di bloccaggio (Vedi Figura 3b, traccia 1, 4 e 5, dispiegarsi di domini Fn)46. Lo stesso problema può verificarsi, se gli esteri NHS attivi del distanziatore PEG sono lasciati insaturi. Pertanto, l'incubazione con soluzione salina tamponata Tris si consiglia (punto 1.2.6), come l'ammina primaria di Tris disseta i restanti gruppi amminici reattivi.
Seguendo il protocollo graduale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sul vetro silanizzata superficie (vedere Figura 2), lasciando una forma dimerica della proteina. Questo assomiglia Fn´s struttura in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici di campione37precedenti-AFM. Inoltre, si ottiene una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM, che genera un valore di destinazione del ~ 20% di eventi di interazione ben definiti durante le misurazioni di SMF (Figura 3 e Figura 4). Un altro modo elegante per controllare la quantità di molecole accoppiato all'estremità del substrato e a sbalzo di campione oltre variando i tempi di concentrazione e/o incubazione di proteina, è la combinazione di silano-agenti con diversi gruppi funzionali secondarie. Modificando il rapporto di gruppi reattivi della proteina, che si estende da PEG-polimero, il numero delle proteine immobilizzate può essere controllata15,16,17,18.
Il protocollo descritto qui è utilizzabile anche per immobilizzare altre molecole contenenti di -NH2 o essere regolato alle proteine di coppia a altra superficie di ossido di silicio oltre nitruro di silicio e vetro. A seconda della struttura della proteina, il gruppo carbossilico reattiva di ammina sono modificabili per un gruppo reattivo solfidrilico (ad es., maleimide o ortho-piridil disolfuro) per accoppiare la proteina tramite il suo libero – gruppi SH. Per Fn, questo comporta un orientamento predefinito13,17,20.
In sintesi, questo protocollo può essere registrato per soddisfare diversi requisiti ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre gli esperimenti di spettroscopia di forza singola molecola.

Al lato di pinzette ottiche e magnetiche, la forza atomica (AFM) microscopio1,2 è emersa come uno strumento utile per analizzare e manipolare molecole e sonda di loro proprietà e funzioni, come la loro risposta a una forza esterna3 ,4. Al contrario ai metodi come l'analisi dell'immunosorbente collegata enzima (ELISA), superficie risonanza plasmonica (SPR) o cristallo di quarzo (QCM) microbilancia configurazioni, AFM permette di misurare le interazioni nella singola molecola (SMF)5 e il livello di singola cellula (SCFS)6 . Queste tecnologie hanno reso informazioni preziose in meccanismi di associazione come i legami di cattura trovati per l'interazione della proteina di e. coli pilus che ripete FimH con mannosio7o il tandem β-cerniera formata da proteine leganti Fn da S. aureus legandosi a Fn8. Siamo stati recentemente in grado di dimostrare che l'adesina pilus-1 RrgA9,10 dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 è in grado di legarsi al fibronectin12 con i suoi due domini terminal. Ciò ha rivelato un nuovo meccanismo di associazione di due domini che differisce dal tandem β-cerniera e può attivare piliated pneumococchi a formare e mantenere una transitoria host contatto al fibronectin-contenenti superfici13.
Il successo di SMF esperimenti dipende criticamente l'immobilizzazione funzionale e nativo di biomolecole su superfici solide e punte dell'AFM. Come forze elevate possono verificarsi durante le misurazioni di SMF, le proteine preferibilmente dovrebbero essere accoppiate covalentemente alla superficie. Ci sono un gran numero di metodi differenti di accoppiamento per l'immobilizzazione di proteine e altre biomolecole, come pure le cellule intere su superfici solide (inorganiche), nano-particelle e altri dispositivi descritti nella letteratura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Questi protocolli fanno spesso uso di sostanze pericolose, sono difficili da eseguire e/o richiedono attrezzature speciali (ad es., plasma cleaner). Un modo semplice per molecole di coppia al vetro è quello di attaccare uno strato più spesso di polimero di reticolanti eterobifunzionali con un gruppo Silano-reattivo su un lato e un gruppo dell'ammina-reattivo loro altro lato. A seconda dell'applicazione, gli agenti di accoppiamento possono essere costituito da catene di idrocarburi flessibili di lunghezza variabile, ad es., polietilenglicole (PEG). Essi sopprimere interazioni non specifiche delle superfici modificate (ad es., idrofobiche, elettrostatiche e van-der-Waals interazioni) e può fornire la libertà rotazionale molecola accoppiati.
Qui, descriviamo un protocollo generale per l'accoppiamento covalente di proteine che contengono uno o più gruppi amminici liberi (-NH2) superfici di vetro e nitruro di silicio AFM suggerimenti tramite un eterobifunzionali etossi Silano-PEG-carbossilico (-COOH). Questo protocollo può essere usato negli esperimenti di SMF, che è esemplificato basati sull'interazione di RrgA e la proteina della matrice extracellulare Fn (vedere la Figura 1 per una panoramica).
Il primo passo è la silanizzazione della superficie28,29,30,31. Coinvolge l'idrolisi dei gruppi etossi dell'agente di accoppiamento al fine di formare gruppi SiOH altamente reattivi. Questi possono reagire con i gruppi SiOH sul substrato. In una condensazione primaria passo, questi legami di idrogeno forma silanoli e diffondere sul substrato. In una reazione di condensazione secondario (che di solito richiede calore o vuoto per rimuovere l'acqua), si formano legami silossanici. In questo modo un strato di covalenza allegato organo-silani.
Il secondo passo è l'accoppiamento delle proteine per il funzionale (-COOH) gruppi che si estendono dal polimero32. In primo luogo, l'acido viene convertito in un estere N-hydroxysuccinimid (NHS) reattivo intermedio, che è acquisito attraverso la consolidata NHS/EDC (1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimid chimica33 e subisce sostituzione nucleofila Infine formare un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine.
In questo modo, RrgA è stato accoppiato a punte dell'AFM nitruro di silicio e umano Fn per substrati di vetro in un orientamento casuale e le loro forze di interazione sono stati analizzati a livello di singola molecola. I nostri risultati indicano che la chimica di superficie descritto conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante le misurazioni di SMF. Questa chimica riduce interazioni aspecifiche sfondo, è soggetto a variazioni poco durante l'acquisizione dei dati e pertanto è perfettamente adatta per gli esperimenti di SMF precisi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

Negli ultimi anni, la microscopia a forza atomica (AFM) basata spettroscopia della forza singola molecola (SMF) estesa la nostra comprensione delle proprietà molecolari e funzioni. Ci ha dato l'opportunità di esplorare una molteplicità di meccanismi biofisici, ad esempio, come batterica adhesins bind per i ricevitori di superficie di host in modo più dettagliato. Tra gli altri fattori, il successo di SMF esperimenti dipende il funzionale e nativo di immobilizzazione di biomolecole di interesse su superfici solide e punte dell'AFM. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'accoppiamento covalente di proteine per superfici di silicio utilizza silano-PEG-carboxyls e la chimica di N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ben consolidata in ordine per esplorare l'interazione di pilus-1 adesina RrgA dal batterio gram-positivo Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) con la matrice extracellulare della proteina fibronectina (Fn). I nostri risultati indicano che la funzionalizzazione superficiale conduce ad una distribuzione omogenea di Fn sulla superficie del vetro e ad una concentrazione appropriata della RrgA sulla punta AFM a sbalzo, apparente per il valore di destinazione fino al 20% degli eventi di interazione durante SMF misure e ha rivelato che RrgA si lega a Fn con una forza media di 52 pN. Il protocollo può essere regolato a coppia tramite sito specifico gratuito gruppi tiolici. Questo si traduce in un orientamento predefinito di proteina o molecola ed è adatto per altre applicazioni biofisiche oltre le SMF.

Il protocollo descritto qui risultati in un'immobilizzazione covalente di proteine tramite loro accessibile ammine primarie con orientazione casuale (Figura 1). Figura 2 Mostra un'immagine AFM di una superficie di vetro silanizzata con (a sinistra) e senza (a destra) Fn immobilizzato, registrata dopo la disidratazione dei campioni sotto una leggera corrente di azoto. Lo strato di polimero Silano presenta solo piccole ondulazioni superficiali con un'altezza di circa 2-5 nm (Figura 2, destra), mentre sulla superficie funzionalizzata con Fn, circa 10 nm alta Fn molecole sono apparente (Figura 2, sinistra). In primi piani, la struttura dimerica della Fn possa essere riconosciuta. Le molecole di Fn sembrano essere compatto con un'altezza di 4-5 nm sopra il rivestimento di superficie di PEG e una lunghezza di ~ 120 nm (vedere inserti).
Per studiare le forze di interazione di RrgA con Fn, che recentemente è stato descritto dettagliatamente dal nostro gruppo13, RrgA è stato accoppiato ad una punta AFM del nitruro di silicio e Fn umano al substrato di vetro (Figura 3a). Figura 3 Mostra la punta rappresentanza curve di separazione dell'interazione di RrgA con Fn registrato ad una velocità di trazione di 1 µm s-1. La chimica delle superfici usata ha condotto ad un'interazione di basso fondo ed eventi di interazione ben sagomato singola (o doppia) (Figura 3a), che sono stati montati utilizzando un worm extensible come modello di catena (eWLC) (curve rosse). Visualizzazione dei risultati della fit (forza di rottura e - lunghezza, Vedi Figura 4) dimostra che dopo aver superato interazioni aspecifiche tra punta AFM e substrato e si estende il linker di PEG (> 70 nm), fino a ~ 19% delle curve di forza ha mostrato la rottura eventi con una rottura media forza per la RrgA - interazione Fn di ~ 52 pN contemporaneamente a una distanza punta-campione di circa 100 nm. In contrasto, una chimica di superficie inapplicabile (qui, tempra omesso con Tris buffered saline Figura 3b) ostacolerà una chiara valutazione degli eventi singola interazione a causa di interazioni aspecifiche, la proteina più vincolanti (traccia 2 e 3) e/o accoppiamento covalente di proteine tra la superficie del campione e la punta AFM a sbalzo. Questo porta a forze di rottura alta (traccia 1) eventualmente accompagnate dal dispiegarsi dei domini della proteina (Fn) (traccia 4 e 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figura 1: panoramica sopra la chimica delle superfici. L'idrolisi di etossi Silano-PEG-carbossilico è seguita dal processo di condensazione sulla superficie del vetro idratata e la formazione di legami incrociati silossano. La reazione di EDC con gruppi carbossilici si traduce in un reattivo o- acylisourea, un mediatore dell'ammina-reattivo con un tempo di dimezzamento estremamente breve in soluzione acquosa (idrolisi). L'intermedio è stabilizzato dalla formazione di un estere NHS che subisce sostituzione nucleofila per infine formano un legame dell'ammide con le ammine primarie sulle proteine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figura 2: Immobilizzazione del fibronectin su un vetro substrato tramite eterobifunzionali etossi Silano PEG agente accoppiante carbossilico. Immagini AFM di vetro funzionalizzato superfici con (a sinistra) e senza (a destra) FN. numeri indicare singole molecole di Fn, che sono distribuite in modo omogeneo sulla superficie del substrato (inserti). Le molecole adottano una struttura dimerica e compatta con un'altezza di 4-5 nm sopra il piolo di rivestimento e una lunghezza di > 100 nm. Questo assomiglia alla struttura del Fn in soluzione ed è coerenza con i dati su altre superfici, per esempio, mica precedenti-AFM (barra della scala di intarsi = 500 nm)37. Di seguito l'AFM immagini sono profili di altezza lungo le linee indicate nelle immagini AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figura 3: illustrazione di un esperimento di SMF e rappresentante forzare le curve di distanza di RrgA - interazione Fn. (a) RrgA e Fn erano covalentemente via Silano etossi eterobifunzionali PEG agente accoppiante carbossilico di un AFM al nitruro di silicio a sbalzo punta e una superficie di vetro, rispettivamente. Rappresentante SMFS forza distanza curve ottenute per RrgA - interazione Fn a una velocità di retrazione di 1 µm s-1 con l'immobilizzazione descritto di RrgA e Fn sono mostrate. Curve rosse rappresentano i PF di extensible vite senza fine-come catena applicati per ottenere forze di rottura e lunghezze. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano 201813. (b) rappresentante SMFS forza curve distanza ottenute per il RrgA - interazione Fn senza tempra con tamponata Tris Salino. In questo caso, l'ammina primaria di Tris era assente così che rimangono attivi esteri NHS sono stati lasciati insaturi durante l'esperimento. Ciò ha condotto alla proteina multi vincolanti (traccia 2 e 3) e il bloccaggio delle proteine tra la superficie e la punta AFM che ha provocato la rottura alta forza accompagnato da (Fn-) dominio spiegamento (tracce 1, 4 e 5; notare le diverse scale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figura 4: distribuzione di forza e lunghezza del singolo RrgA - interazioni Fn. Rottura forza e corrispondenti istogrammi di lunghezza di rottura ottenuti da RrgA - misurazioni di interazione a Fn SMF (n = 1400) ad una velocità di retrazione di 1 µm s-1. Gli istogrammi rivelano un più probabile rottura forza fMP di 51,6 pN (Gauss adatta, linea nera) e un accumulo di lunghezze di rottura circa 100 nm. La figura è stata modificata da Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

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