Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
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TB e HG reconhecem apoio financeiro através do Conselho Europeu de investigação "Cellufuel, avançado Grant n. º 294438". HCS reconhece o apoio financeiro do Ministério Federal de educação e investigação através da proteína de Technofunktionale de Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconhece financeira apoio do Ministério do estado da Baviera para a ciência e a educação através do foco de investigação "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Agradecemos a Conny Hasselberg-Christoph e Martina Hörig para suporte técnico

Os autores não têm nada para divulgar.

Desde a introdução do AFM baseado SMFS, evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente intra e intermoleculares forças de individuais de proteínas, ácidos nucleicos e outras biomoléculas3,4,5. Para experiências bem sucedidas de SMFS, uma superfície adequada estratégia de acoplamento é um pré-requisito. Para sondar as forças intramoleculares em polímeros naturais e sintéticos, os polímeros podem ser acoplados diretamente à superfície do substrato e AFM dica36,38,39,40,41. Para a investigação de interações inter moleculares, tais como ligações moleculares, no entanto, é aconselhável a utilização de moléculas de vinculador flexível como hetero-bifuncional PEG linkers, ou as correntes do polypeptide, anexar os parceiros de interação para a ponta AFM e o superfície do substrato, para permitir a orientação correta dos parceiros vinculação, para superar as forças de superfície de curto alcance e evitar a desnaturação e desdobramento de proteínas21,22,23, 24,25,26,,27,42. Portanto, descrevemos um protocolo simples e direta para a imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis usando espaçadores de PEG hétero-bifuncional.
Temos demonstrado sua aplicabilidade com a investigação da interação forças entre adesina RrgA de S. pneumoniae e a proteína da matriz extracelular Fn, como recentemente descrito em detalhe em outro lugar13.
A química de superfície é bem estabelecida e abordagens analisadas e similares têm sido utilizadas com sucesso em vários SMFS experimentos19,42,,43,44,45. O silylether utilizado para acoplamento do polímero de silano na superfície, está sujeita a hidrólise. O grau de hidrólise depende da quantidade de títulos de siloxano formado, o que pode ser controlado durante o processo de silanização. Se forças de interação alta (≥ 1000 pN) são esperadas durante as medições de SMFS, a silanização deve ser realizada através do vapor-fase deposição30 que resulta na formação de uma camada contínua de siloxanos. Quanto a muitas experiências (por exemplo, muitas proteínas – interações da proteína), as forças de interação estão na faixa de uns cem pN e o procedimento descrito, na qual siloxano formação é realizada pela deposição de uma fase aquosa e desassociada organo-silanos são cuidadosamente lavado com etanol (etapa 1.1.7), seguido de fotopolimerização com calor (etapa 1.1.8), é suficientes.
Outro passo crítico é para lavar o restante EDC e moléculas de NHS fora da superfície (etapa 1.2.3), como as sobras conduzirá à ativação de grupos carboxila sobre as proteínas. Isto pode de qualquer resultado na reticulação de proteínas na mesma superfície, que pode alterar a sua funcionalidade ou covalentemente casal ativado proteínas a outras proteínas na superfície oposta. Isso pode levar à fixação das proteínas entre a superfície e a ponta AFM, que resulta em ruptura alta forças eventualmente acompanhadas de desdobramento do domínio (ver Figura 3b, rastreamento de 1, 4 e 5, desdobramento de domínios Fn)46. O mesmo problema pode ocorrer, se os ésteres de NHS ativos do espaçador de PEG são deixados insaturados. Portanto, a incubação com soro fisiológico Tris em buffer é recomendável (etapa 1.2.6), como a amina primária de Tris sacia os grupos restantes de aminoácidos reativos.
Seguindo o protocolo gradual leva a uma distribuição homogénea das Fn no vidro silanizadas de superfície (ver Figura 2), deixando uma forma dimérica da proteína. Isto assemelha-se a estrutura de Fn´s em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies de amostra37. Além disso, uma concentração adequada de RrgA na ponta AFM é obtida, o que gera um valor-alvo de ~ 20% dos eventos de interação bem definidas durante as medições de SMFS (Figura 3 e Figura 4). Outra maneira elegante para controlar a quantidade de moléculas acoplado à ponta de substrato e cantilever com amostra além variando os tempos de concentração e/ou incubação de proteína, é a combinação de silano-agentes com diferentes grupos de funcionais secundários. Alterando a proporção dos grupos reativo proteína, estendendo-se desde o PEG-polímero, o número de proteínas imobilizadas pode ser controlada15,16,17,18.
O protocolo descrito aqui também pode ser usado para imobilizar outras moléculas contendo de2 -NH ou ser ajustados às proteínas par a outra superfície de óxido de silício, além de nitreto de vidro e silicone. Dependendo do design de proteína, o grupo carboxila reativas amina pode ser alterado para um grupo sulfidrila reativos (por exemplo, maleimide ou orto-pyridyl dissulfeto) para acoplar a proteína através de seu livre – grupos SH. Para Fn, isso resulta em uma orientação predefinida13,17,20.
Em resumo, este protocolo pode ser ajustado para atender diferentes necessidades e é adequado para outras aplicações biofísicas além de experimentos de espectroscopia de força única molécula.

Ao lado da pinça óptica e magnética, a força atômica (AFM) de microscópio1,2 surgiu como uma ferramenta útil para analisar e manipular moléculas e suas propriedades e funções, incluindo a sua resposta à força externa3 da sonda ,4. Em contraste aos métodos como o ensaio de imunoabsorção ligado de enzima (ELISA), surface ressonância plasmon (SPR) ou configurações de cristal de quartzo micro-balança (QCM), AFM permite medir interações sobre a única molécula (SMFS)5 e o nível de célula única (SCFS)6 . Estas tecnologias renderam insights valiosos sobre mecanismos de ligação como os laços de capturas para a interação de Escherichia coli pilus proteína que fimh com manose7, ou o conjunto β-zíper repete formada por proteínas obrigatórias do Fn de S. aureus sobre vinculação a Fn8. Fomos recentemente capazes de mostrar que a adesina pilus-1 RrgA9,10 de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 é capaz de ligar a fibronectina12 com seus dois domínios terminais. Isto revelou um novo mecanismo de ligação de dois domínios que difere o β-zíper em tandem e pode permitir que piliated pneumococos formar e manter um transiente anfitrião contato para fibronectina contendo superfícies13.
O sucesso das experiências SMFS depende criticamente a imobilização funcional e nativa das biomoléculas sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Como forças elevadas podem ocorrer durante as medições de SMFS, as proteínas de preferência devem ser covalentemente acopladas à superfície. Há um grande número de métodos diferentes de acoplamento para a imobilização de proteínas e outras biomoléculas, bem como células toda sobre superfícies sólidas (inorgânicas), nano-partículas e outros dispositivos descritos na literatura14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Estes protocolos, muitas vezes fazem uso de substâncias perigosas, são difíceis de realizar e/ou exigir equipamento especial (por exemplo, plasma líquido de limpeza). Uma maneira simples de moléculas de casal para vidro é anexar uma espessa camada de polímero de heterobifunctional crosslinkers com um silano-reativo de um lado e um grupo amina-reativa seu outro lado. Dependendo da aplicação, os agentes de acoplamento podem incluir flexíveis cadeias de hidrocarbonetos de comprimento variável, por exemplo., polyethylenglycol (PEG). Eles suprimem interacções não-específicas das superfícies modificadas (por exemplo, hidrofóbicas, eletrostáticas e as interações de van-der-Waals) e podem fornecer a liberdade rotacional da molécula acoplado.
Aqui, descrevemos um protocolo geral para o acoplamento covalente de proteínas contendo um ou mais grupos aminoácidos livres (-NH2) de vidro, superfícies e nitreto de silício AFM dicas através de um heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxila (-COOH). Este protocolo pode ser usado em experimentos SMFS, que é exemplificado com base na interação de RrgA e proteínas da matriz extracelular Fn (ver Figura 1 para obter uma visão geral).
O primeiro passo é a silanização da superfície28,29,30,31. Envolve a hidrólise dos grupos etoxi do agente de acoplamento para formar grupos de SiOH altamente reativos. Estas podem reagir com grupos de SiOH no substrato. Em uma condensação primária passo, estas ligações de hidrogênio de forma silanols e espalhe sobre o substrato. Em uma reação de condensação secundária (que geralmente requer calor ou vácuo para remover a água), siloxano ligações são formadas. Isso resulta em uma camada de organo-silano covalentemente ligados.
O segundo passo é o acoplamento das proteínas para o funcional (-COOH) grupos que se estendem da polímero32. Primeiro, o ácido é convertido em um éster de N-hydroxysuccinimid (NHS) reativo intermediário, que é adquirido através do NHS/EDC bem estabelecida (1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química33 e sofre substituição nucleofílica Finalmente formar um vínculo de Amida com aminas primárias sobre as proteínas.
Desta forma, RrgA foi acoplado ao dicas AFM de nitreto de silício e Fn humana para substratos de vidro em uma orientação aleatória e suas forças de interação foram analisadas ao nível da molécula. Nossos resultados mostram que a química de superfície descrita conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante as medições de SMFS. Esta química reduz as interações de fundo específico, está sujeita a alteração pouco durante a aquisição de dados e, portanto, é excelentemente adequada para experimentos SMFS precisos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

Nos últimos anos, microscopia de força atômica (AFM) com base em espectroscopia de força única molécula (SMFS) estendida a nossa compreensão das funções e propriedades moleculares. Deu-na oportunidade de explorar uma multiplicidade de mecanismos biofísicos, por exemplo, como bacteriana adesinas se ligam a receptores de superfície de acolhimento mais detalhadamente. Entre outros fatores, o sucesso das experiências SMFS depende a imobilização funcional e nativa das biomoléculas de interesse sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Aqui, descrevemos um protocolo simples para o acoplamento covalente de proteínas a superfícies de silício usando silano-PEG-carboxyls e a química N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (CED/NHS) bem estabelecida na ordem para explorar a interação de adesina pilus-1 RrgA de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), com a matriz extracelular da proteína fibronectina (Fn). Nossos resultados mostram que a superfície functionalization conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta do modilhão AFM, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante SMFS medições e revelou que RrgA vincula a Fn com uma força média de 52 pN. O protocolo pode ser ajustado para o casal através de site específico livre grupos tiol. Isso resulta em uma orientação predefinida de proteína ou molécula e é adequado para outras aplicações biofísicas além as SMFS.

O protocolo descrito aqui resulta em uma imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis com orientação aleatória (Figura 1). A Figura 2 mostra uma imagem AFM de uma superfície de vidro silanizadas com (esquerda) e sem (à direita) Fn imobilizada, gravado após a desidratação das amostras sob uma ligeira corrente de nitrogênio. A camada de polímero de silano mostra apenas corrugações superfície pequenas com uma altura de aproximadamente 2-5 nm (Figura 2, direita), enquanto na superfície acrescida com Fn, aproximadamente 10 nm alta Fn moléculas são aparente (Figura 2, à esquerda). Em close-ups, a estrutura dimérica do Fn pode ser reconhecida. As moléculas de Fn parecem ser compacto, com uma altura de 4-5 nm acima o revestimento de superfície de PEG e um comprimento de ~ 120 nm (ver inserções).
Para investigar as forças de interação de RrgA com Fn, que recentemente foi descrito detalhadamente por nosso grupo13, RrgA foi acoplado a uma ponta AFM de nitreto de silício e Fn humana ao substrato de vidro (Figura 3a). A Figura 3 mostra representativa ponta curvas de separação de amostra da interação do RrgA com Fn gravado a uma velocidade puxa de 1 µm s-1. A química de superfície utilizada levada a uma interação de baixo fundo e eventos de interação individual (ou duplo) bem formados (Figura 3a), que foram instalados usando um verme extensível como modelo de cadeia (eWLC) (curvas de vermelhos). Plotar os resultados do ajuste (força de ruptura e - comprimento, ver Figura 4) mostra que, após superar a superfície inespecificas entre ponta AFM e substrato e os linkers PEG (> 70 nm), estendendo-se até ~ 19% das curvas força mostrou ruptura eventos com uma ruptura significa forçar para o RrgA - interação de Fn de ~ 52 pN em uma distâncias de ponta-amostra de cerca de 100 nm. Em contraste, uma química de superfície inaplicável (aqui, extinguendo omitido com Tris tamponada salina Figura 3b) apresentará uma avaliação clara dos eventos de interação única devido às interações inespecíficas, múltiplos proteína de ligação (traço 2 e 3) e/ou acoplamento covalente de proteínas entre a superfície da amostra e a ponta do modilhão AFM. Este leva a ruptura alta forças (traço 1) eventualmente acompanhadas de desdobramento dos domínios da proteína (Fn) (traço 4 e 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figura 1: visão geral sobre a química de superfície. A hidrólise de etoxi silano-PEG-carboxila é seguida pela sua condensação na superfície de vidro hidratado e a formação de ligações cruzadas de siloxano. A reação de EDC com os grupos carboxila resulta em um reativo o- acylisourea, um intermediário reativo-amina com uma meia-vida extremamente curta em solução aquosa (hidrólise). O intermediário é estabilizado pela formação de um éster de NHS que sofre substituição nucleofílica para finalmente formar uma ligação Amida com aminas primárias sobre as proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figura 2: Imobilização de fibronectina em um vidro substrato através de heterobifunctional etoxi silano PEG agente de acoplamento de carboxila. Imagens AFM de vidro funcionalizado superfícies com (esquerda) e sem (direita), nota de rodapé números indicam moléculas individuais de Fn, que são distribuídas homogeneamente na superfície do substrato (inserções). As moléculas adotam uma estrutura dimérica e compacta, com uma altura de 4-5 nm acima o PEG revestimento e um comprimento de > 100 nm. Isto assemelha-se a estrutura da Fn em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies, por exemplo, mica (barra de escala de embutimentos = 500 nm)37. Abaixo o AFM imagens são perfis de altura ao longo das linhas indicadas nas imagens de AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figura 3: ilustração de um experimento SMFS e representante forçar curvas de distância da RrgA - interação de Fn. (a) RrgA e Fn foram ligados covalentemente através de silano etoxi heterobifunctional PEG agente de acoplamento carboxila de um AFM de nitreto de silício do modilhão dica e uma superfície de vidro, respectivamente. Representante SMFS forçar distância curvas obtidas para RrgA - interação de Fn a uma velocidade de retração de 1 µm s-1 com a imobilização descrita de RrgA e Fn são mostradas. As curvas vermelhas representam o fits extensível tipo worm cadeia aplicado para obter forças de ruptura e comprimentos. A figura foi modificada de Becke, et al, 2018 ACSnano13. (b) representante SMFS forçar curvas distância obtidas para o RrgA - interação de Fn sem têmpera com Tris-buffered salina. Neste caso, a amina primária de Tris estava ausente para que o restante ativo ésteres NHS foram deixados insaturados durante o experimento. Isto levou à proteína multi ligação (traço 2 e 3) e a fixação de proteínas entre a superfície e a ponta AFM que resultou na ruptura alta força domínio acompanhados (Fn-) desdobramento (rastreamento 1, 4 e 5; Observe as diferentes escalas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figura 4: distribuição de força e comprimento de RrgA único - interações Fn. Ruptura força e correspondente histogramas de comprimento de ruptura obtidas de RrgA - medições de interação Fn SMFS (n = 1400) a uma velocidade de retração de 1 µm s-1. Os histogramas revelam um mais provável ruptura força fMP de 51.6 pN (Gauss caber, linha preta) e um acúmulo de comprimentos de ruptura em torno de 100 nm. A figura foi modificada de Becke, et al, ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

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