Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

ТБ и HG признаем финансовую поддержку через Европейский исследовательский совет «Cellufuel, дополнительно грант № 294438». HCS признает финансовой поддержке федерального министерства для образования и научных исследований через Innovationsallianz Technofunktionale белки (TeFuProt), SS признает финансовую поддержку от баварского государственного министерства науки и образования через фокус исследования «Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - КАНТЕР». Мы благодарим Конни Hasselberg-Кристоф и Мартина Hörig для технической поддержки

Авторы не имеют ничего сообщать.

Поскольку введение AFM на основе функций SMF, она превратилась в широко используемый метод непосредственно зондировать интра- и межмолекулярных сил индивидуальных белков, нуклеиновых кислот и других биомолекул3,4,5. Для успешных экспериментов SMF-функции соответствующей поверхности муфты стратегия является обязательным условием. Зонда внутримолекулярной силы в природных и синтетических полимеров, полимеры могут быть напрямую соединен поверхности субстрата и AFM Совет36,,3839,40,41. Для расследования между молекулярных взаимодействий, например молекулярных связей, однако это рекомендуется использовать гибкие компоновщика молекул, таких как гетеро бифункциональных PEG линкеры или полипептидных цепей, чтобы прикрепить взаимодействия партнеров к кончику AFM и поверхность субстрата, с тем чтобы обеспечить правильную ориентацию партнеров привязки, преодолеть ближней поверхности силы и чтобы избежать денатурации и разворачивается белки21,,2223, 24,-25,-26,-27,-42. Поэтому мы описали простой и прямой вперед протокол для ковалентной иммобилизации белков через их доступных первичных аминов, используя гетеро бифункциональных PEG распорки.
Мы продемонстрировали свою применимость с исследованием взаимодействия сил между принимает RrgA от S. pneumoniae и белков внеклеточного матрикса Fn, как недавно подробно описаны в других13.
Химии поверхности хорошо организованной и проанализированных и аналогичные подходы успешно использовались в нескольких SMF-функций эксперименты19,42,,4344,45. Silylether, используемые для муфты силана полимера к поверхности, подлежит гидролиза. Степень гидролиза зависит количество сформированных силоксановых облигации, которые можно контролировать в процессе silanization. Если высокая взаимодействия сил (≥ 1000 pN) ожидаются во время измерений SMF-функций, silanization должно быть осуществляется через паровой фазы осаждения30 которой приводит к образованию сплошным слоем силоксанов. Что касается многих экспериментов (например, много белок-белковых взаимодействий) силы взаимодействия находятся в диапазоне от нескольких сотен pN, и описанная процедура, в которой силоксановых формирование осуществляется путем осаждения из водной фазы и несвязанных органо силанов тщательно смывается с этанолом (шаг 1.1.7) следуют отверждения с тепла (шаг 1.1.8), является достаточным.
Еще один важный шаг, чтобы вымыть оставшиеся EDC и NHS молекул с поверхности (шаг 1.2.3), как остатки приведет к активации карбоксильных групп белков. Это может либо результат в сшивки белков на одной поверхности, который может изменить их функциональность или ковалентно пара активации белков для других белков на противоположной поверхности. Это может привести к зажимать белков между поверхностью и кончик AFM, что приводит к высокий разрыв сил, возможно в сопровождении разворачивается домена (см. Рисунок 3b, трассировки 1, 4 и 5, разворачивается Fn доменов)46. Такая же проблема может произойти, если активный NHS эфиры ПЭГ распорку остаются ненасыщенных. Таким образом инкубация с трис-буфер солевой раствор рекомендуется (шаг 1.2.6), как первичные амины трис утоляет оставшиеся аминогруппами реактивной.
После поэтапного протокол приводит к равномерное распределение Fn на стекле silanized поверхности (см. Рисунок 2), оставляя димерной формы белка. Это напоминает Fn´s структуры в растворе и согласуется с предыдущей AFM данных на других поверхностях образца37. Кроме того получено соответствующей концентрации RrgA на кончике AFM, который создает целевое значение ~ 20% событий четко взаимодействия во время измерений SMF-функций (рис. 3 и рис. 4). Другой элегантный способ, чтобы контролировать количество молекул, в сочетании с кончик подложки и консольные образца Помимо различной концентрации и/или инкубации раз белка, является сочетание силана агентов с различных вторичных функциональных групп. Изменяя соотношение белка реактивной групп простирается от PEG-полимер, количество подвижности белков может быть контролируемой15,16,17,18.
Протокол, описанные здесь, также может использоваться для иммобилизации других молекул, содержащих2 -NH или скорректировать пара белки на другой поверхности оксида кремния, кроме стекла и кремния нитрид. В зависимости от дизайна белка, Амин реактивной Карбоксильная группа может быть изменен на сульфгидрильных реактивной группу (например, maleimide или орто пиридил дисульфида) пара белков через его бесплатно-SH-группами. Для Fn это приводит в предопределенных ориентации13,17,20.
Таким образом этот протокол может быть скорректирована выполнять различные требования и подходит для других биофизических приложений, помимо одной молекулы силой спектроскопии экспериментов.

Рядом с оптические и Магнитные пинцеты атомно-силового микроскопа (AFM)1,2 стала полезным инструментом для анализа и манипулировать молекул и зондировать их свойства и функции, включая их реакции на внешние силы3 ,4. В отличие от методов как assay энзим связанный иммуносорбента (ELISA), поверхности плазмон резонанс (СРП) или кварцевый микровзвешивания (QCM) установок, АСМ позволяет измерить взаимодействия на уровне одной молекулы (SMF)5 и одну ячейку (заявок)6 . Эти технологии принесли ценную информацию в механизмы привязки как поймать облигации, найденных для взаимодействия E. coli pilus белка FimH с7маннозы или тандем β-молния повторяет формируется Fn связывания белков из S. aureus после привязки к Fn8. Недавно мы смогли показать, что принимает pilus-1 RrgA,9,10 из грамположительные бактерии Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 возможность привязки к фибронектин12 с двух терминалов доменов. Это показал новый механизм привязки двух домен, который отличается от тандем β-молния и может позволить piliated пневмококков формировать и поддерживать переходные контактные фибронектин содержащих хост поверхностей13.
Успех SMF-функций экспериментов критически зависит от функциональных и родной иммобилизации биомолекул на твердых поверхностях и AFM советы. Как высокий силы могут произойти во время измерений SMF-функций, белки должны предпочтительно ковалентно сочетаться на поверхности. Существует большое количество методов различных муфта для иммобилизации белков и других биомолекул, а также всей клетки (неорганические) твердых поверхностей, нано частиц и другие устройства, описанные в литературе14,15 ,16,,1718,19,20,21,,2223,24, 25,,2627. Эти протоколы часто делают использование опасных веществ, трудно выполнять и/или требуют специального оборудования (например, чистого плазмы). Простой способ для молекул пара стекла является придавать более толстым слоем полимера heterobifunctional сшиватели с силана реактивной группы на одной стороне и Амин Реактивная группа на их стороне. В зависимости от приложения, агенты сцепления может состоять из гибких гидро углеродной цепи переменной длины, например., полиэтиленгликоля (PEG). Они подавляют неспецифичные взаимодействия изменение поверхностей (например, гидрофобный, электростатического и ван дер Ваальса взаимодействий) и может предоставлять спаренных молекулы вращательных свободы.
Здесь мы описываем общий протокол для ковалентной сцепления белков, содержащих один или более свободные амино группы (-NH2) для стеклянных поверхностей и нитрид кремния AFM советы через heterobifunctional ethoxy силана PEG-карбоксильной (-COOH). Этот протокол может использоваться в SMF-функции экспериментов, которые проявляется на основе взаимодействия RrgA и белков внеклеточного матрикса Fn (см. Рисунок 1 обзор).
Первым шагом является silanization поверхности28,,2930,31. Это включает в себя гидролиз ethoxy групп сцепления агента для того, чтобы сформировать Высокореактивная SiOH групп. Они могут реагировать с SiOH группами на подложке. В первичной конденсации шаг, эти silanols формы водородных связей и распространение на подложке. В реакции конденсации вторичных (который обычно требует тепла или пылесос для удаления воды) образуются силоксановых облигации. Это приводит в слое ковалентно прилагаемый органо силана.
Вторым шагом является муфта белков для функционального (-COOH) групп, которые простираются от полимера32. Во-первых, кислота преобразуется в реактивной эфира N-hydroxysuccinimid (NHS) промежуточные, который достигается через устоявшихся Трансплантология/EDC (1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid химии33 и подвергается нуклеофильного замещения окончательно сформировать амидных связей с первичных аминов на белки.
Таким образом RrgA был соединен кремния нитрид AFM советы и человека Fn для стеклянных субстратов в случайные ориентации и их взаимодействия сил были проанализированы на уровне одной молекулы. Наши результаты показывают, что описанные химии поверхности приводит к равномерное распределение Fn на поверхности стекла и соответствующей концентрации RrgA на кончике, очевидно, от целевого значения до 20% событий взаимодействия во время измерений SMF-функции. Эта химия уменьшает фон неспецифичные взаимодействия, подлежит мало изменения во время сбора данных и поэтому отлично подходит для точных SMF-функций экспериментов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

В последние годы атомно-силовой микроскопии (АСМ) на основе одной молекулы силой спектроскопии (SMF) расширить наше понимание молекулярных свойств и функций. Это дало нам возможность исследовать разносторонность биофизических механизмов, например, как бактериальные адгезины привязку к поверхности рецепторы принимающей более подробно. Среди прочих факторов успех экспериментов SMF-функции зависит от функциональных и родной иммобилизации биомолекул интерес на твердых поверхностях и AFM советы. Здесь мы опишем простой протокол для ковалентной сцепления белков на поверхности кремния с помощью силана PEG-carboxyls и устоявшихся химии N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/ГСЗ) в порядке изучение взаимодействия pilus-1 принимает RrgA от грамположительные бактерии Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) с фибронектин белков внеклеточного матрикса (Fn). Наши результаты показывают, что Функционализация поверхности приводит к равномерное распределение Fn на поверхности стекла и соответствующей концентрации RrgA на кончике консольные AFM, очевидно, от целевого значения до 20% событий взаимодействия во время SMF-функций измерения и показал, что RrgA связывается с Fn средней численностью 52 pN. Протокол можно подобрать пару через сайт конкретных бесплатно тиоловых групп. Это приводит в предопределенных белка или молекулы ориентации и подходит для других биофизических приложений помимо SMF-функции.

Протокол описано здесь результаты в ковалентной иммобилизации белков через их доступных первичных аминов с случайные ориентации (рис. 1). Рисунок 2 показывает AFM изображение поверхности стекла silanized с (слева) и без (справа) Fn прикол, записанный после обезвоживания проб под нежный поток азота. Полимерный слой силана показывает только небольшой поверхности гофрами высотой приблизительно 2-5 Нм (рис. 2, право), а на поверхности функционализированных с Fn, приблизительно 10 Нм высокой Fn молекулы являются очевидными (рис. 2, слева). В приближении может быть признано димерной структура Fn. Fn молекулы, как представляется, быть компактным с высоты 4-5 Нм выше PEG покрытия и длиной ~ 120 Нм (см. вставки).
Для изучения взаимодействия сил RrgA с Fn, который был недавно подробно описал в нашей группе13, RrgA был связан наконечник AFM нитрида кремния и человека Fn на стеклянной подложке (рис. 3a). Рисунок 3 показывает представительный Совет пример разделения кривые взаимодействия RrgA с Fn, записанная на потянув скорость 1 мкм s-1. Используемые химии поверхности, привело к более низких фоновых взаимодействия и стройные взаимодействия единого (или двухместный) события (Рисунок 3А), которые были установлены с помощью расширяемой червь как модель цепочки (eWLC) (красные кривые). Построение эпюр результатов fit (разрыв силы и - длина, см. Рисунок 4) показывает, что после преодоления неспецифической поверхности взаимодействия между AFM наконечник и субстрат и растяжения линкеры ПЭГ (> 70 нм), вплоть до ~ 19% силы кривых показан разрыв события с означает разрыв силу для RrgA - Fn взаимодействия ~ 52 pN на расстояниях образца tip около 100 Нм. В отличие от неприменимым химии поверхности (здесь, опущен закалки с трис буфер солевой Рисунок 3b) будет препятствовать четкую оценку событий взаимодействия одного из-за неопределенного взаимодействия, несколько белков, привязки (след 2 и 3) и/или Ковалентный муфта белков между поверхностью образца и кончик консольные AFM. Это приводит к высокой разрыв сил (след 1) возможно в сопровождении разворачивается из доменов протеина (Fn) (след 4 и 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Рисунок 1: обзор за химии поверхности. Гидролиз ethoxy силана PEG-карбоксильной следуют его конденсации на поверхности увлажненной стекла и формирование силоксановых сшивки. Реакция EDC с карбоксильной группы приводит к реактивной o- acylisourea, Амин реактивного промежуточного с чрезвычайно короткий период полураспада в водном растворе (гидролиз). Промежуточных стабилизируется формирования Эстер NHS, которая подвергается нуклеофильного замещения сформировать наконец амидных связей с первичных аминов на белки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Рисунок 2: Иммобилизация фибронектин на стеклянной подложке через heterobifunctional ethoxy силана PEG карбоксильной муфта агент. АСМ изображения функционализированных стеклянных поверхностей с (слева) и без (справа) Fn. цифры указывают отдельные Fn молекулы, которые равномерно распределены на поверхности субстрата (вставки). Молекулы принять димерной и компактная структура с высотой 4-5 Нм выше КОЛЫШЕК покрытие и длиной > 100 Нм. Это очень напоминает структуру Fn в растворе и согласуется с предыдущей AFM данных на других поверхностях, например, Слюда (шкалы бар вставками = 500 Нм)37. Ниже АСМ изображения являются высота профилей по направлениям, указанным в АСМ изображения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Рисунок 3: Иллюстрация функций SMF эксперимент и представитель сил расстояние кривые RrgA - Fn взаимодействия. () RrgA и Fn были ковалентно связанного через heterobifunctional ethoxy силана PEG карбоксильной муфта агент нитрида кремния AFM консольные наконечник и поверхности стекла, соответственно. Представитель SMF-функций силу расстояние приведены кривые, полученные для RrgA - Fn взаимодействия со скоростью Ретракция 1 мкм s-1 с описанной иммобилизации RrgA и Fn. Красные кривые представляют подходит расширяемый червь как цепь, применяется для получения силы разрыв и длины. Рисунок был изменен Becke, et al., ACSnano 201813. (b) представитель SMF-функций силу расстояние кривые, полученные для RrgA - Fn взаимодействия без закалки с трис-буфер солевой. В этом случае отсутствовала Первичные амины трис так что остальные активные NHS эфиры остались ненасыщенных во время эксперимента. Это привело к multi белка привязки (след 2 и 3) и зажима белков между поверхностью и кончик AFM, что привело к высокой разрыв сил сопровождаются (Fn-) домена разворачивалась (трассировки 1, 4 и 5; Обратите внимание различных масштабах). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Рисунок 4: силу и длина распределения одного RrgA - Fn взаимодействий. Разрывная сила и соответствующий разрыв длина гистограммы, полученные от RrgA - Fn SMF-функций взаимодействия измерений (n = 1400) со скоростью Ретракция 1 мкм s-1. Гистограммы показывают наиболее вероятным разрыв силы fMP 51.6 pN (Гаусс подходят, черная линия) и накопление разрыв длиной около 100 Нм. Рисунок был изменен с Becke, 2018 et al., ACSnano,13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Этот протокол описывает ковалентной иммобилизации белков с heterobifunctional силана муфта агент поверхности оксида кремния, предназначенные для атомно-силовой микроскопии основанные одной молекулы силой спектроскопии который подтверждается взаимодействие RrgA (pilus-1 Cовeт принимает из S. pneumoniae) с фибронектин.

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-опосредованный ферментативный синтез и иммобилизация полимеризованного белка для одномолекулярной силовой спектроскопии

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...