Name: covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

TB och HG bekräftar ekonomiskt stöd genom Europeiska forskningsrådet ”Cellufuel, avancerade Grant nr 294438”. HCS erkänner ekonomiskt stöd från det federala departement för utbildning och forskning genom den Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS erkänner finansiella stöd från bayerska statliga ministeriet för vetenskap och utbildning genom forskningsfokus ”Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - galopp”. Vi tackar Conny Hasselberg-Christoph och Martina Hörig för teknisk support

1. immobilisering av proteiner via funktionell silan koppling agenter
Obs: Figur 1 ger en översikt över de ytkemi som tillämpas i detta protokoll.
Varning: I följande protokoll används olika kemikalier med frätande och hud irriterande egenskaper. Bär lämpliga (syrafast) handskar, skyddsglasögon och laboratorierock och arbeta under spiskåpa medan du förbereder lösningar för att undvika inandning av ångor.
<ol><li>Funktionalisering av glasytor och kisel nitriden fribärande med silan koppling agenter<ol>
<li>Ta bort grova damm och föroreningar från glasskivor med isopropanol och luddfri precision våtservetter och skär bilderna i önskad storlek (valfritt). Obs: Bredvid glas, solid yta kan vara kiseldioxid, kvarts och kväveoxiderna som aluminium, koppar, tenn, Titan, järn, krom, zirkonium, nickel och zink. FÖRSIKTIGHET: Skära glas glasen kan orsaka skarpa kanter.</li>
		<li>Plats glaset glider i en färgning burk fylld med saltsyra (33% HCl) utspädd med dubbeldestillerat vatten (ddH2O) till 3-5% (v/v), Stäng burken med lämpliga locket och placera den i ett ultraljudsbad under 90 minuter vid rumstemperatur. Obs: Använd burken har en diameter på 6 cm och en ungefärlig storlek på 65-70 mL. En lämplig volym av utspädd HCl för burken är 50 mL innehållande 5 mL 33% HCl och 45 mL ddH2O. HCl effektivt tar bort icke-bindande metalljoner, särskilt natrium, kalium och kalcium och minskar kisel för att producera en hydroxyl mättade glasyta. Varning: HCl är frätande och irriterande för huden. Använd adekvat syrabeständiga handskar, skyddsglasögon och laboratorium päls och arbeta under spiskåpa medan beredning av lösningen för att undvika inandning av ångor.</li>
		<li>Placera den kiselnitrid AFM cantilever sonder på ett rent objektglas med spetsen uppåt och bestråla med ultra violett ljus från ovan för minst 90 min. Anmärkning: För enda molekyl kraft spektroskopi, utliggare med en nominell våren konstant 0,01 till 0,1 N m-1 är lämplig. Bestrålning av fribärande yta med UV-ljus kommer att ta bort organiska föroreningar, främst feta ämnen, och göra det hydrofila på ena sidan. Om den andra sidan är kraftigt förorenad - som inte bör vara fallet, eller om de fribärande sonderna används färska ur leverantörernas box - det kan påverka SMFS mätningen. En grundlig rengöring av hela fribärande chip med piranha lösning, som har använts i många studier34, kan hjälpa. FÖRSIKTIGHET: UV-ljus är skadligt för ögonen; bestrålning av fribärande sonderna bör därför genomföras i en UV ljus ogenomträngliga kammare. Piranha lösning är mycket reaktiva och kan bränna huden, papper och annat organiskt material. Använd inte plastbehållare. Om rätter eller burkar även med små mängder av organiska ytan föroreningar (t.ex., från tidigare användning), kan det reagera snabbt.</li>
		<li>Ersätt saltsyra i färgning burken med ddH2O utan att låta glasytan torkar och placera burken tillbaka i ultraljudsbadet för en annan 10 min. ersätta vattnet två gånger i 10 min respektive att ordentligt tvätta bort saltsyra syra.</li>
		<li>Under tiden, lös etoxi (eller metoxi) silan polyetylenglykol syra (Si (OC2H5)3-PEG-COOH) i en blandning av etanol och ddH2O (v/v 95% / 5%, pH 4,6 justeras med ättiksyra) till en slutlig koncentration på 0,1 mg mL -1. Förvara lösningen hermetiskt tillslutna för att undvika avdunstning av etanol. Obs: Silan koppling agenter är känsliga för fukt och temperatur. Därför bör de förvaras under inert gas (N2), vid låg temperatur (-20 ° C) och under torra förhållanden. Innan du öppnar kolven, se till att silaner nått rumstemperatur för att minimera återfuktning och därmed passivering av reaktiva grupper. Heterobifunctional PEG koppling agenter finns med många olika funktionella grupper och olika spacer längder. För slumpmässiga immobilisering av proteiner via vara deras fria aminogrupper (NH2), som beskrivs i detta protokoll, den funktionella gruppen ytterligare till den etoxi/metoxi silan en NHS-ester. Bredvid inköp av en silan agent med NHS ester, ett enkelt sätt att få sådana NHS ester är att aktivera en karboxylgrupp grupp (-COOH) med 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) och NHS (se 1.2.1. och 1.2.2.). Varning: Etanol är brandfarliga och hud irriterande. Ättiksyra är brandfarligt och frätande. Se till att inte få reaktiva silaner på huden eller i ögonen. Använd lämpliga skyddshandskar, skyddsglasögon och laboratorierock och arbeta under spiskåpa för att undvika inandning av ångor.</li>
		<li>Häll över silan lösningen i två separata petriskålar, placera beredd fribärande sonder och glasskivor i en petriskål respektive, tätar hermetiskt (t.ex. parafilm) för att undvika avdunstning av etanol och inkubera stillastående under 90 minuter vid rumstemperatur. Obs: Den optimala storleken på petriskål beror på antalet fribärande sonder och storleken på de glasskivor som bör vara functionalized. En diameter storlek för god hantering och låga reagens volym är 50-60 mm. För att undvika oönskad böjning av uthänget medan tränga igenom luft vatten gränssnittet av uthänget bör hållas i en 90° vinkel till luft-vatten-gränssnittet. Inkubering av glas glasen (men inte de fribärande sonderna) kan eventuellt utföras i orbitalskak.</li>
		<li>Skölj cantilever och glas glasen i tre på varandra följande bägare som innehåller ren etanol att helt tvätta bort de obundna silan föreningarna. Obs: För att undvika oönskad böjning av uthänget medan tränga igenom luft vatten gränssnittet, uthänget bör hållas i en 90° vinkel.</li>
		<li>Placera functionalized glas glasen i färgning burken och av uthänget på ett rent objektglas och härdning vid 110 ° C i 30 min. Obs: Bota med värme inducerar bildandet av kovalent siloxan obligationer och avlägsnande av vatten. Som glaset bilder var bara functionalized å ena sidan, se till att korrekt kunna ange den bestrukna sidan.</li>
		<li>Lagra silaniserad glas proverna och fribärande sonder i vakuum exsickator för upp till en vecka. Obs: Protokollet kan pausas här.</li>
	</ol></li>
	<li>Slumpmässiga immobilisering av proteiner på silaniserad glas och kisel nitriden fribärande Obs: För att undvika oönskad böjning av uthänget, fribärande sonden bör hållas i en 90° vinkel medan tränga någon luft-vatten-gränssnitt.<ol>
<li>Förbered en lösning innehållande 42 mg mL-1 av EDC och 20 mg mL-1 NHS i standard fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4). FÖRSIKTIGHET: EDC är frätande och huden irriterar huden och kan orsaka allvarliga ögonskador. Använd lämpliga skyddshandskar, skyddsglasögon och laboratorierock.</li>
		<li>Täcka silan belagda glas glasen med lösningen och sätta silaniserad fribärande sonder i en droppe av EDC/NHS lösningen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Obs: För inkubering av fribärande sonderna, fribärande originalkartong är lämplig. Att proteiner via deras fria aminogrupper till carboxyls (-COOH) av heterobifunctional silan-PEG agenter, aktiveras den - COOH-gruppen med den utbredda EDC/NHS kemin. EDC par NHS till en karboxylsyra, bildar en ”stabil” NHS ester som möjliggör effektiv konjugation till primära aminer vid Fysiologiskt pH i ett nästa steg.</li>
		<li>Skölj cantilever och glas glasen noga med PBS i tre på varandra följande bägare för att helt tvätta bort överdriven EDC/NHS. Obs: Denna tvätt steg är kritiska som återstående EDC/NHS kan crosslink proteiner och förändra därmed deras funktionalitet.</li>
		<li>Inkubera i aktiverade glasskivor med och av uthänget sonder i en droplet-fil av önskad protein lösningen i en fuktig kammare vid rumstemperatur. Protein koncentration och inkubation tiden bör anpassas till kraven i experimentet. I allmänhet en koncentration mellan 0,5 till 1 mg mL-1 och inkubation gånger från 30 min till 2 h som passar de flesta proteiner. När det gäller Fibronektin (på glasskiva) och pilus-1 tip protein RrgA (på fribärande), en molar koncentration av 1,5 µM och 3 µM, respektive, och en inkubationstid av 2 h är tillräckliga.</li>
		<li>Tvätta glasskivor och uthänget sonder grundligt med PBS i tre på varandra följande bägare för att tvätta av obundna proteiner.</li>
		<li>Mätta den återstående NHS estern med tris (hydroxymetyl)-aminomethan genom att placera sonderna i tris-buffrad koksaltlösning (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) i 20 min i rumstemperatur. Obs: Detta steg minskar oönskad kovalent koppling av proteiner mellan functionalized ytan av AFM spetsen och glas, eftersom amino grupper av Tris kan binda till de återstående aktivera COOH grupperna på fribärande och substrat yta.</li>
		<li>Tvätta glasskivor och uthänget sonder grundligt med PBS och lagra dem i separata petriskålar omfattas i PBS fram till användning. Obs: Proven bör beredas på nytt och använt samma dag.</li>
	</ol></li>
</ol>2. atomic Force Microscopy baserat enda molekyl kraft spektroskopi
Obs: I detta arbete, en atomic force Mikroskop från JPK instrument användes och uppsättningen ups för att få kraft-avstånd kurvor definierades med den tvinga RampDesigner.
<ol><li>Fribärande kalibrering med thermal buller metod35 Obs: För fribärande kalibrering, Följ steg i handboken till tillverkaren. De flesta cantilever leverantörer staten en ungefärlig våren konstant, som beräknas vanligen från formen nominella fribärande (längd, bredd, tjocklek) och är därför inte särskilt tillförlitliga. Konstanten rätt våren är avgörande, lönar det sig att genomföra den fribärande kalibrering som beskrivs nedan i tre exemplar och använda medelvärdena för optisk spaken känslighet och våren konstant. Det kan vara bra att spela in den fribärande deformationen i volt (V) under experimentet och konvertera betyder det att tvinga (pN) efteråt, använder den optiska spaken känsligheten och våren konstanta värden. Våren konstant och optiska spaken känslighet kan bestämmas före eller efter experimentet, så länge laser position inte ändras på uthänget (placera av den återspeglas lasern kan justeras på fotodioden).<ol>
<li>Fixa en ren, fräsch glasskiva på AFM provhållaren och täck den med PBS-bufferten. Obs: Kalibreringen bör utföras på en hård yta (t.ex., glas) och i samma bufferten som riktiga experimenten.</li>
		<li>Fixa beredda fribärande sonden på fribärande innehavaren, placera den i AFM huvudet och noggrant våt av uthänget med en droppe PBS-bufferten. Obs: Vätning av uthänget minskar ytspänningen som förekommer under penetration i PBS-bufferten på kalibrering glas bilden och därmed oönskade böjning av uthänget.</li>
		<li>Långsamt flytta av uthänget mot kalibrering ytan tills fribärande är helt nedsänkt i PBS-bufferten men fortfarande bort från kalibrering ytan.</li>
		<li>Använda det optiska mikroskopet ovanifrån av AFM eller (om tillgängligt) inverterade mikroskopet under AFM att positionera lasern av AFM på baksidan av uthänget. Placera lasern plats nära slutet av uthänget nära där spetsen ligger. Obs: Laser plats bör placeras nära slutet av uthänget, men det bör fortfarande vara helt på fribärande. Om ingen optiskt mikroskop är tillgänglig, Använd ett papper för synliga laserdioder eller laser detektor-kort för infraröd laserdioder, lägga den under chefen för AFM och flytta laser plats mot kanten av fribärande-chip, där utliggare finns , tills du ser plats på papper eller detektor. Flytta sedan lasern parallellt med kant. När fläcken försvinner, är det på en fribärande arm. För linjära utliggare, flytta plats mot slutet av hävarmen tills det visas på papper/detektor kortet och flytta tillbaka den tills den är igen på den Hävarm (försvinner från papper/kort). För triangulära, placera platsen i mitten mellan två armar av uthänget och flytta den mot slutet av uthänget, tills den försvinner från papper/kort. Kontrollera att du är i mitten av uthänget genom att flytta den plats vinkelrätt till den långa axeln av uthänget.</li>
		<li>Justera positionen för de fyra kvadranten detektor fotodioden av AFM på ett sådant sätt att den reflekterade laserstrålen är placerad i mitten av en fotodiod. Obs: Gör så här: Använd Mikrometern skruvar nära detektorn dioden för att flytta dioden i horisontell och i vertikal riktning, tills summan signalen från alla fyra kvadranter är maximerat. Sedan flytta dioden i vertikal riktning, tills signalen vertikal deformation är noll, och flytta dioden i horisontell riktning, tills den laterala böjning signalen är noll. Silicon nitriden utliggare vanligtvis har en Guldbeläggning och är därför ett bimetal med två olika koefficienter av termisk expansion. Detta resulterar i en termisk drift (uppenbara i vertikal deformation signalen) särskilt i lösning. För att minska denna drift under mätningarna, låt hela systemet jämvikta i några minuter innan kalibreringen.</li>
		<li>Öppna hanteraren för kalibrering i programvaran AFM och kalibrera den fribärande känslighet och våren konstant av uthänget med metoden termisk buller enligt följande.</li>
		<li>Försiktigt närma sig ytan substrat och registrera en kraft-avstånd kurva.</li>
		<li>Bestämma den optiska spaken känsligheten i nm/V genom att montera en rak linje till den brantaste delen av retraktion kraft kurvan, där spetsen är i kontakt med substratet ytan. Känsligheten gör för att konvertera konstanten fribärande våren till pN/nm. Obs: Lutningen på kurvan returgående fas är piezo resa avstånd vs. ändringen i fotodiod spänning (mätt i nm/V).</li>
		<li>Spela in flera thermal buller spektra av uthänget med den fribärande ungefär 100 µm eller mer bort från ytan för att utesluta någon yta dämpning.</li>
		<li>Bestäm konstanten våren av uthänget i pN/V genom att montera en harmonisk oscillator som tillhandahålls av programvaran AFM till thermal buller spektra.</li>
		<li>Långsamt tillbaka av uthänget och återkalla det från lösningen.</li>
		<li>Substitut glasytan används för fribärande kalibrering med prov ytan som innehåller de immobiliserade proteinerna. Kontrollera att uthänget och prov yta (och därmed proteinerna) torka inte fördriva tiden omväxlar glasskivor.</li>
	</ol></li>
	<li>Interaktion tvinga experiment på den enda proteinnivå<ol>
<li>Långsamt flytta fuktiga uthänget mot provet ytan tills fribärande är helt täckt av PBS-bufferten men fortfarande bort från substrat yta. Obs: För att minska termiska drivan under experimentet, låt hela systemet för några minuter innan du börjar kraft spektroskopi mätningarna.</li>
		<li>Närma sig ytan och spela in flera kraft-avstånd kurvor (≥ 500) på olika platser av provet ytan, med en kontakt bestående av 250 pN, en tid av 1 s, en dementi längd av 2 µm och en dementi hastighet 1 µm s-1. Obs: För allmän kraft spektroskopi justeringar, följ tillverkarens bruksanvisning. Variationer: Dementi hastigheten kan varieras mellan 0,1 och 5 µm s-1 för att beräkna kinetical data beroende på ökande kraft belastningen. Interaktion tiden kan varieras för att analysera tid beroende av bond förstärkning. Istället för att hålla returgående fas hastighet konstant, kan man hålla konstanten kraft (kraft klämma läge).</li>
	</ol></li>
	<li>Analys av data Obs: Dataanalys genomfördes med hjälp av databehandling programvara. Beroende på de immobiliserade proteinerna, kontakttiden eller indragning hastigheten, huruvida ett fotavtryck inkorporerades eller inte och andra variabla parametrar, innehålla kraft-avstånd kurvorna flera olika information. Dataanalys och tolkning kan variera kraftigt mellan olika SMFS experiment och kan därför inte beskrivas i detalj här. När det gäller samspelet mellan RrgA och Fn, kan följande protokoll vara ett första steg för analys av SMFS data.<ol>
<li>Öppna de uppmätta kraften kurva filerna genom att välja öppna Batch av tvinga ikonen Scan och bearbeta den kraft-avstånd kurvor enligt följande:</li>
		<li>Konvertera den fribärande deformationen (V) till den direkt proportionell kraften (F) genom att välja ikonen (Re) Kalibrera V-omläggning av justera känslighet och våren konstant . Obs: Om fribärande kalibrering utfördes innan experimentet, värdena sparas i kraft skanningsfiler och används automatiskt under kalibrering av V-omläggning. Om kalibreringen utfördes efter experimentet, använder programvaran standardvärden, som kan ändras till de uppmätta värdena.</li>
		<li>Subtrahera baslinjen för returgående fas kanalen i en region i kurvan kraft långt från ytan för att ange noll kraft nivån genom att välja ikonen Baslinjen subtraktion. Obs: I vissa fall den returgående fasen kan inte ha samma konstant kraft värde och kurvan kan visa en linjär tilt, som kan tas bort genom att välja Offset + Tilt.</li>
		<li>Definiera den punkt där spets kommer i kontakt med provet genom att välja ikonen Kontakta peka bestämning .</li>
		<li>Konvertera höjd signalen till tip-prov separation genom att välja ikonen Tip-Sample Separation . Förutom att subtrahera kontaktpunkt position, subtraherar proceduren av uthänget böjning för att beräkna avståndet mellan substrat yta och AFM-spets. Obs: För montering polymer elastisk modeller, som den extensible mask-liknande-kedja-modellen, och bestämning av interaktion längder, tip-prov avskiljandet, som är korrigerat för fribärande böjning, behövs. För att avgöra den kraft som lastning hastighet från lutningen på kurvan kraft och z-piezo hastigheten, bör okorrigerad kraft kurvor användas.</li>
		<li>Skärmen kraft-avstånd spår för kraft toppar inträffar vid bristning längder över 70 nm (längd utsträckt PEG mellanlägget)36 och sortera ut ospecifik interaktioner som du kan tillämpa den extensible mask-liknande-kedja-modellen till de valda topparna genom att välja de Passar en Polymer kedjan modell ikonen och valde den utbyggbar maskliknande försörjningskedjan modell. Topparna i returgående fas kraft kurvan kommer att utrustas med denna modell och bristning styrkor och längder erhålls, tillsammans med elastisk parametrarna av polymeren.</li>
		<li>Visa data som histogram som visar kraft och längd fördelningarna. Använd minst 100 unbinding händelser för histogram.</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

Eftersom införandet av AFM baserade SMFS, utvecklades det till en allmänt använd teknik för att direkt probe intra och intermolekylära krafter av enskilda proteiner, nukleinsyror och andra biomolekyler3,4,5. För framgångsrika SMFS experiment är en lämplig yta koppling strategi en förutsättning. För att undersöka de intramolekylära krafterna i naturliga och syntetiska polymerer, kan polymerer vara direkt kopplad till substrat yta och AFM tips36,38,39,40,41. För utredning av Inter molekylära interaktioner, såsom molekylär obligationer, är det dock tillrådligt att använda flexibla linker molekyler som hetero-bifunktionell PEG linkers eller polypeptidkedjor, bifoga interaktion partnerna till AFM spetsen och substrat yta, för att möjliggöra korrekt orientering av de bindande partnerna, att övervinna short-range ytan krafter och undvika denaturering och unfoldingen av proteiner21,22,23, 24,25,26,27,42. Vi har därför beskrivs ett enkelt och rakt framåt protokoll för kovalent immobilisering av proteiner via deras tillgängliga primära aminer som använder hetero-bifunktionell PEG distanser.
Vi visat dess tillämplighet med utredningen av samspelet krafterna mellan adhesin RrgA från S. pneumoniae och extracellulär matrix protein Fn, som nyligen beskrivs i detalj på annan plats13.
Ytkemi är väl etablerad och analyserade och liknande metoder har använts med framgång i flera SMFS experiment19,42,43,44,45. Den silylether som används för koppling silan polymeren till ytan, är föremål för hydrolys. Graden av hydrolys beror på mängden bildade siloxan obligationer, som kan kontrolleras under processen silanisering. Om hög interaktion styrkor (≥ 1000 pN) förväntas under SMFS mätningar, bör silanisering utförs via gasfasen nedfall30 vilket resulterar i bildandet av en kontinuerlig lager av siloxaner. När det gäller många experiment (t.ex., många protein-proteininteraktioner) är interaktion krafter i spänna av några hundra pN, och beskrivs förfarandet, i vilka siloxan bildandet är utförs av nedfall från en vattenfas och obundet Organo-silaner är omsorgsfullt tvättas bort med etanol (steg 1.1.7) följt av härdning med värme (steg 1.1.8), är tillräckligt.
Ett annat viktigt steg är att tvätta den återstående EDC och NHS molekyler av ytan (steg 1.2.3), eftersom resterna kommer att leda till aktivering av carboxyl grupper på proteiner. Detta kan antingen leda crosslinking av proteiner på samma yta, som kan förändra deras funktionalitet eller kovalent par aktiveras proteiner till andra proteiner på den motsatta ytan. Detta kan leda till fastspänning av proteiner mellan ytan och AFM spetsen, vilket resulterar i höga bristning styrkor eventuellt åtföljd av domän utspelar sig (se figur 3b, spår 1, 4 och 5, unfoldingen av Fn domäner)46. Samma problem kan uppstå om de aktiva NHS estrar av PEG distansringen kvar omättade. Inkubering med Tris buffrad koksaltlösning rekommenderas därför (steg 1.2.6), som den primära aminen av Tris släcker de återstående amino reaktiva grupperna.
Efter protokollet stegvis leder till en homogen fördelning av Fn på silaniserad glas ytan (se figur 2, lämnar en dimeriskt form av protein). Detta liknar Fn´s struktur i lösning och är förenligt med tidigare AFM data på andra provet ytor37. Dessutom erhålls en lämplig koncentration av RrgA AFM spets, vilket genererar ett målvärde på ~ 20% av väldefinierade interaktion händelser under SMFS mätningar (figur 3 och figur 4). En annan elegant sätt att kontrollera mängden molekyler kopplat till provet substrat och fribärande spetsen förutom varierande de protein koncentration eller inkubation tiderna, är kombinationen av silan-agenter med olika sekundära funktionella grupper. Genom att ändra förhållandet mellan protein reaktiva grupper sträcker sig från PEG-polymer, kan antalet immobiliserade proteiner vara kontrollerad15,16,17,18.
Protokollet beskrivs här kan också användas för att immobilisera andra -NH2 innehållande molekyler eller justeras till par proteiner till annan kiseloxid yta förutom glas och kisel nitriden. Beroende protein design, gruppen amine reaktiva carboxyl kan ändras till en sulfhydryl reaktiv grupp (t exmaleimide eller ortho-pyridyl disulfid) till par den protein via dess fria – SH grupper. För Fn resulterar detta i en fördefinierad orientering13,17,20.
Sammanfattningsvis, detta protokoll kan justeras för att tjäna olika krav och är lämplig för andra biofysiska program förutom enda molekyl kraft spektroskopi experiment.

Bredvid optiska och magnetiska pincetter, atomic force Mikroskop (AFM)1,2 har vuxit fram som ett användbart verktyg för att analysera och manipulera molekyler och sond sina egenskaper och funktioner, inklusive deras svar på yttre våld3 ,4. I kontrast till metoder som de enzym länkade immunosorbent assay (ELISA), ytan plasmon resonans (SPR) eller quartz crystal microbalance (QCM) uppställningar, AFM tillåter för att mäta interaktioner på enda molekyl (SMFS)5 och enda cellnivå (SCFS)6 . Dessa tekniker gav värdefull insikt i bindande mekanismer som fångst obligationerna hittade för växelverkan av E. coli pilus protein FimH med mannos7eller tandem β-dragkedjan upprepar bildas av Fn-bindande proteiner från S. aureus vid bindning till Fn8. Vi har nyligen kunnat visa att den pilus-1 adhesin RrgA9,10 från grampositiva bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 är kan binda till Fibronektin12 med dess två terminal domäner. Detta avslöjade en ny två-domän bindande mekanism som skiljer sig från tandem β-dragkedjan och kan aktivera piliated pneumokocker att bilda och underhålla en övergående kontakt till Fibronektin-innehållande värd ytor13.
Framgången av SMFS experiment är kritiskt beroende av funktionella och infödda immobilisering av biomolekyler på fasta ytor och AFM tips. Som höga krafter kan förekomma under SMFS mätningar, bör proteinerna helst vara kovalent kopplat till ytan. Det finns ett stort antal olika koppling metoder för immobilisering av proteiner och andra biomolekyler, samt hela celler på (oorganisk) fasta ytor, nano-partiklar och andra enheter som beskrivs i litteratur14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Dessa protokoll gör ofta användning av farliga ämnen, är svåra att utföra och/eller kräver specialutrustning (t.ex., plasma renare). Ett enkelt sätt att par molekyler att glas är att bifoga ett tjockare polymerskikt av heterobifunctional bindemedel med silan-reaktivt på ena sidan och en amine-reaktiv grupp på sin andra sida. Beroende på applikation, koppling agenter kan omfatta flexibla kolvätebaserade kedjor av variabel längd, t.ex., polyethylenglycol (PEG). De undertrycka icke-specifika interaktioner av modifierade ytbehandlar (e.g., hydrofoba, elektrostatiska och van-der-Waals interaktioner) och kan ge kopplat molekyl roterande friheten.
Här beskriver vi ett allmänt protokoll för kovalent kopplingen av proteiner som innehåller en eller flera fria aminogrupper (-NH2) till glas ytor och kiselnitrid AFM tips via en heterobifunctional etoxi silan-PEG-karboxylgrupp (-COOH). Detta protokoll kan användas i SMFS experiment, som exemplifieras utifrån samspelet mellan RrgA och extracellulär matrix protein Fn (se figur 1 för en översikt).
Det första steget är silanisering av ytan28,29,30,31. Det innebär hydrolys av etoxi grupperna av koppling agenten för att bilda mycket reaktiva SiOH grupper. Dessa kan reagera med SiOH grupper på substratet. I en primär kondens steg, dessa silanols bilda vätebindningar och sprids på substratet. I en sekundär Kondensationsreaktion (vilket oftast kräver värme eller vakuum för att avlägsna vatten), siloxan obligationer bildas. Detta resulterar i ett kovalent bifogade organo-silane lager.
Det andra steget är kopplingen av proteinerna till den funktionella (-COOH) grupper som sträcker sig från den polymer32. Först, syran konverteras till en reaktiv N-hydroxysuccinimid (NHS) ester mellanliggande, vilket är vunnits genom väletablerade NHS/EDC (1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid kemi33 och genomgår nukleofil substitution att slutligen bilda ett amide bond med primära aminer på proteiner.
På detta sätt RrgA kopplades till kisel nitriden AFM tips och mänskliga Fn att glas substrat i en slumpmässig orientering och deras interaktion styrkor analyserades på nivån enda molekyl. Våra resultat visar att de beskrivna ytkemi leder till en homogen fördelning av Fn på glasytan och till en lämplig koncentration av RrgA på spetsen, uppenbart av målvärdet för upp till 20% av interaktion händelser under SMFS mätningar. Detta kemi minskar icke-specifik bakgrund interaktioner, är lite ändras under datainsamling och passar därför utmärkt för exakt SMFS experiment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03450</td>
			<td>EDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3738</td>
			<td>100 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doubly distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065</td>
			<td>&#8805; 99.8 %; analytical purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethoxy silane polyethylene glycol acid</td>
			<td>Nanocs</td>
			<td>PG2-CASL-5k</td>
			<td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X896</td>
			<td>32 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>804518</td>
			<td>NHS; for synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline - Dulbecco</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L1825</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe molecule e.g. RrgA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchlorid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9265</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE15</td>
			<td>&#8805; 99,3 %; TRIS; Buffer Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inert gas desiccator</td>
			<td>Sicco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard 1</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td>
			<td>JPK Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory oven</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter</td>
			<td>Knick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td>10-100 &#181;l, 50-200 &#181;l, 100-1000&#160;&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Acculab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon nitride cantilever - MLCT</td>
			<td>Bruker AXS S.A.S</td>
			<td></td>
			<td>Spring constant &#8804; 100 pN/nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope - Zeiss Stemi</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech science precision wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twezzers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV PenRay</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>90-0012-01</td>
			<td>Mercury spectrum with the primary energy at 254&#160;nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TP64</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

covalent immobilization of proteins for the single molecule force spectroscopy

Under de senaste åren baserat atomic force microscopy (AFM) enda molekyl kraft spektroskopi (SMFS) utökat vår förståelse av molekylära egenskaper och funktioner. Det gav oss möjlighet att utforska en multiplicity av biofysiska mekanismer, t.ex., hur bakteriell adhesiner binda till värd yta receptorer i mer detalj. Bland annat beror framgången av SMFS experiment på funktionella och infödda immobilisering av biomolekyler sevärdheter på fasta ytor och AFM tips. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för kovalent kopplingen av proteiner till kisel ytor med silan-PEG-carboxyls och väletablerade N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) kemi i ordning att utforska samspelet mellan pilus-1 adhesin RrgA från grampositiva bakterien Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) med den extracellulära matrix protein Fibronektin (Fn). Våra resultat visar att den ytan funktionalisering leder till en homogen fördelning av Fn på glasytan och till en lämplig koncentration av RrgA AFM fribärande spets, uppenbart av målvärdet för upp till 20% av interaktion händelser under SMFS mätningar och avslöjade att RrgA binder till Fn med en genomsnittlig kraft 52 pN. Protokollet justeras till par via specifika gratis tiol för webbplatsgrupper. Detta resulterar i en fördefinierad protein eller molekyl orientering och är lämplig för andra biofysiska program förutom SMFS.

Protokollet beskrivs här resulterar i en kovalent immobilisering av proteiner via deras tillgängliga primära aminer med slumpmässig orientering (figur 1). Figur 2 visar en AFM bilden av silaniserad glasyta med (vänster) och utan (höger) Fn orörlig, inspelad efter dehydratisering av proverna under en svag luftström kväve. Silan polymer lagret visar endast små ytan mönster med en höjd av cirka 2-5 nm (figur 2, höger), medan på ytan functionalized med Fn, ca 10 nm hög Fn molekyler är uppenbara (figur 2, vänster). I närbilder, kan dimeriskt strukturen i Fn kännas. Fn molekylerna verkar vara kompakt med en höjd av 4-5 nm ovan PEG ytbeläggningen och en längd av ~ 120 nm (se bilagor).
För att undersöka interaktionen krafter RrgA med Fn, som nyligen beskrivs i detalj i vår grupp13, var RrgA kopplat till en silicon nitriden AFM spets och mänskliga Fn att glassubstrat (figur 3a). Figur 3 visar representativa tip prov separation kurvor av växelverkan av RrgA med Fn registreras med dragande hastighet 1 µm s-1. Den används ytkemi ledde till en låg bakgrund interaktion och välformade enda (eller dubbla) interaktion händelser (figur 3a), som utrustades med en extensible mask som kedja (eWLC) modell (röda kurvor). Plottning resultaten av passformen (brista kraft och -längd, se figur 4) visar att efter att övervinna ospecifika Ytinteraktioner mellan AFM tip substrat och stretching av PEG linkers (> 70 nm), upp till ~ 19% av kraft kurvorna visade bristning händelser med en genomsnittlig brista kraft för RrgA - Fn växelverkan av ~ 52 pN på en tip-prov avstånd av ca 100 nm. I kontrast, en tillämplig ytkemi (här utelämnade snabbkylning med Tris buffrad koksaltlösning figur 3b) kommer att hindra en tydlig utvärdering av enda interaktion händelser på grund av ospecifika interaktioner, flera protein bindande (spår 2 och 3) och/eller kovalent koppling av proteiner mellan prov ytan och AFM fribärande spetsen. Detta leder till hög bristning krafter (spår 1) åtföljd av unfoldingen av protein (Fn) domäner (spår 4 och 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> Figur 1: översikt över ytkemi. Hydrolys av etoxi silan-PEG-carboxyl följs av dess kondensation på hydrerad glasytan och bildandet av siloxan antipyridinantikropp. Reaktionen av EDC med grupperna carboxyl resulterar i en reaktiv o- acylisourea, en amine-reaktivt mellanliggande med en extremt kort halveringstid i vattenlösning (hydrolys). Intermediären stabiliseras av bildandet av en NHS-ester som genomgår en nukleofil substitution för att slutligen bilda en amid med primära aminer på proteiner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> Figur 2: Immobilisering av Fibronektin på ett glas substrat via heterobifunctional etoxi silan PEG carboxyl koppling agent. AFM bilder av functionalized glas ytor med (vänster) och utan (höger) fotn siffrorna anger enskilda Fn-molekyler, som fördelas homogent substrat yta (skär). Molekylerna anta en dimeriskt och kompakt struktur med en höjd på 4-5 nm ovan PEG beläggning och en längd på > 100 nm. Detta liknar Fn struktur i lösning och är förenligt med tidigare AFM data på andra ytor, t.ex., mica (skalstapeln av inlays = 500 nm)37. Nedanför AFM är bilder höjd profiler längs de linjer som anges i AFM bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> Figur 3: Illustration av SMFS experiment representant tvinga avstånd kurvor av RrgA - Fn interaktion. (a) RrgA och Fn var kovalent länkade via den heterobifunctional etoxi silan PEG carboxyl koppling agent till en kiselnitrid AFM cantilever spets och en glasyta, respektive. Representant SMFS kraft avstånd erhålls för RrgA - Fn interaktion med returgående fas hastighet 1 µm s-1 med beskrivs immobilisering av RrgA och Fn-kurvor visas. Röda kurvor representerar den extensible maskliknande kedja passar tillämpas för att erhålla bristning styrkor och längder. Figuren har ändrats från Becke, et al., ACSnano 201813. (b) representant SMFS kraft avstånd kurvor erhålls för RrgA - Fn interaktion utan kylning med Tris buffrad koksaltlösning. I detta fall den primära aminen av Tris var frånvarande så att återstående aktiva NHS estrar lämnades omättade under experimentet. Detta ledde till multi protein bindande (spår 2 och 3) och den fastspänning av proteiner mellan ytan och AFM spets vilket resulterade i höga bristning styrkor åtföljs av (Fn-) domän utspelas (spår 1, 4 och 5, notera olika skalor). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> Figur 4: kraft och längd fördelning av enstaka RrgA - Fn interaktioner. Brista kraft och motsvarande bristning längd histogram erhålls från RrgA - Fn SMFS interaktion mätningar (n = 1400) med returgående fas hastighet 1 µm s-1. Histogrammen avslöjar en mest trolig bristning kraft fMP av 51,6 pN (Gauss passar, svarta linjen) och en ansamling av bristning längder runt 100 nm. Figuren har ändrats från Becke, et al., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Det här protokollet beskriver kovalent immobilisering av proteiner med heterobifunctional silan kontaktmedel kiseloxid ytor avsedda för den atomic force microscopy baserat enda molekyl kraft spektroskopin som exemplifieras av den växelverkan av RrgA (pilus-1 tip adhesin av S. pneumoniae) med Fibronektin.

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...