Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

De studie werd gefinancierd (toegekend aan F-Q. Z.) door NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), de Craig H. Neilsen Foundation en de Stichting BrightFocus.

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig het dierlijke protocol goedgekeurd door het Johns Hopkins institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. materialen en reagentia
<ol><li>
Dieren
	<ol>
<li>Gebruik de zes weken oude vrouwelijke CF1 muizen met een gewicht van 30 – 35 g voor de experimenten. Opmerking: De muizen waren groep-gevestigd (5 muizen per kooi) in apart geventileerde gesteriliseerde kooien met 1/4" corn cob beddengoed en 2" vierkante nestlets vo...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Verschillende chirurgische stappen moet bijzondere aandacht. De L4 en L5 DRG (locatie van SOMA), die de nervus ischiadicus domineren, moeten correct worden geïdentificeerd en ingespoten met gene constructies. Anders, het GFP-labeling afwezig zal zijn in de Ischiaszenuw axonen. De iliacale toppen kunnen worden beschouwd als nuttig anatomische monumenten te lokaliseren L4 en L5 DRG. In de meeste muizen is het gemeenschappelijke tussen L5 en L6 wervels facet naaste iliac toppen12. Als alternatief, L...

Verwondingen in het zenuwstelsel veroorzaakt door neurale trauma of verschillende neurodegeneratieve ziekten meestal resulteren in defecten in motorische, zintuiglijke en cognitieve functies. Onlangs, heeft veel moeite besteed aan herstel van het regeneratieve potentie in volwassen neuronen te herstellen van de fysiologische functionsof gewond neuronen1,2,3. Sensorische neuronen in de DRG zijn een cluster van zenuwcellen die verschillende zintuiglijke prikkels, zoals pijn, temperatuur, touch of lichaamshouding, naar de hersenen doorgeven. Elk van deze neuronen is pseudo-unipolaire en bevat een enkele axon die bifurcates met één tak uitbreiding naar de periferie en de andere tak die richting het ruggenmerg4. De volwassen sensorische neuronen in DRG behoren tot een paar volwassen zoogdieren neuronen bekend om te regenereren hun axonen actief na blessure. Vandaar, beschadigingen van sensorische axonen zijn uitgebreid tewerkgesteld als een cruciale model te bestuderen van de mechanismen van axonale regeneratie in vivo.
In vivo gene transfectie technieken, die meestal minder tijdrovende instellen en flexibeler dan het gebruik van transgene dieren, speel essentiële rol in het bestuderen van de functies van genen en signalering van trajecten in het zenuwstelsel. De belangrijkste technieken kunnen worden onderverdeeld in twee benaderingen: instrument- en virus gebaseerde5. Viral gebaseerde in vivo gene levering in volwassen neuronen kan bieden nauwkeurige Spatio manipulatie van gen expressie6. Arbeidsintensieve processen zijn echter betrokken bij virale gebaseerde methoden, zoals de productie en zuivering van virale deeltjes die met het gewenste gen. Daarnaast kunnen veel virale vectoren activeren het immuunsysteem van de gastheer, die kan interfereren met de data-acquisitie, data-analyse en de interpretatie van de experimentele resultaten mogelijk te misleiden. Electroporation, een typisch instrument gebaseerde transfectie aanpak, gebruikt een elektroimpuls te vergroten van de permeabiliteit van de cel en nucleaire membranen Transient, die gunsten van de toestroom van gene vectoren of kleine RNA oligos vanuit de ruimte buiten de cellen7 . In vitro electroporation wordt algemeen erkend als een voorbijgaande maar zeer efficiënte strategie voor het manipuleren van gerichte genexpressie in veel celtypen. Hoewel in vivo electroporation alleen tot voorbijgaande genexpressie met lage transfecting efficiëntie ten opzichte van virale vectoren leidt, heeft diverse voordelen ten opzichte van virale benaderingen. Bijvoorbeeld, kan het worden toegepast op vrijwel alle weefsels en cellen7,8,-9. Bovendien ofwel plasmiden genen-of-interest of kleine RNA oligos (b.v., siRNAs, microRNAs) tegen bepaalde afschriften codering kunnen worden geïnjecteerd rechtstreeks in het doelweefsel en dan elektrisch gepulseerde, waardoor de procedure minder arbeid - en tijd - consumeren. Bovendien is het mogelijk meerdere plasmiden en RNA oligos gelijktijdig met één electroporation transfecting.
We hebben vastgesteld van een in vivo electroporation aanpak om te manipuleren genexpressie in volwassen muis sensorische neuronen en met succes toegepast en gevalideerd dergelijke aanpak in talrijke pionier studies1,,2,3 ,8,10. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol ter vergemakkelijking van het gebruik van deze benadering voor toekomstige studies van zoogdieren axon regeneratie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Electroporation is een essentiële, niet-virale gen transfectie benadering te introduceren van DNA-plasmiden of kleine molecules van RNA in cellen. Een sensorisch neuron in de achterwortelganglia ganglion (DRG) strekt zich uit van een enkele axon met twee takken. Eén tak gaat naar de perifere zenuwen (perifere tak), en de andere tak voert het ruggenmerg via de achterwortelganglia (centrale tak). Na de neurale letsel regenereert de perifere tak krachtig overwegende dat de centrale tak doet niet regenereren. Als gevolg van de hoge regeneratief vermogen, zintuiglijke axon regeneratie wijd gebruikt als een modelsysteem te onderzoeken zoogdieren axon regeneratie in zowel het perifere zenuwstelsel (PNS) en het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier beschrijven we een protocol van tevoren vastgelegde benadering om te manipuleren genexpressie in volwassen sensorische neuronen in vivo via electroporation. Op basis van transfectie met plasmiden of kleine oligos van RNA (siRNAs of microRNAs), de aanpak maakt het mogelijk voor beide experimenten van de verlies - en winst-van-functie te bestuderen van de rol van genen-van-belangen of microRNAs in verordening van axon regeneratie in vivo. Bovendien, de manipulatie van gen expressie in vivo controleerbaar zowel stoffelijk als ruimtelijk binnen een relatief korte tijd cursus. Dit modelsysteem biedt een uniek instrument voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen waarmee zoogdieren axon regeneratie gereglementeerde in vivo is.

Te kwantificeren van de cytotoxiciteit van het huidige protocol en om te valideren dat transfectie in vivo DRG electroporation is hoog genoeg, we geïnjecteerd en electroporated fluorescently-tagged microRNA of siRNA in L4 en L5 DRG. De vrijstaande DRG werden verwerkt via cryo-segmenteren en immunohistochemistry (Figuur 1A-B). Bij de berekening van de cel overlevingskansen na injectie en electroporation, waren de intact DRG van L4 en...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion at JoVE.com

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modellering van kanker zoals Neurale Invasion: De dorsale wortel ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Ganglion Injection en dorsale Root crush als een model voor Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomy voor lumbale achterwortelganglia Ganglion toegang en injectie in varkens

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...