Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
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Die Studie wurde gefördert (F-q ausgezeichnet. Z.) von NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Craig H. Neilsen Foundation und der BrightFocus-Stiftung.

Alle Tierversuche wurden gemäß dem tierischen Protokoll durch die Johns Hopkins institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt durchgeführt.
(1) Materialien und Reagenzien
<ol><li>
Tiere
	<ol>
<li>Verwenden Sie sechs Wochen alten weiblichen CF1 Mäuse mit einem Gewicht von 30 – 35 g für die Experimente. Hinweis: Die Mäuse waren Gruppe untergebracht (5 Mäusen pro Käfig) in individuell belüfteten sterilisierte Käfigen mit 1/4" Corn Cob Betten und 2" quad...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

Mehrere chirurgische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die L4 und L5 DRGs (Lage des Somas), die den Ischiasnerv zu beherrschen, müssen korrekt erkannt und mit Genkonstrukte injiziert werden. Andernfalls werden die GFP-Kennzeichnung fehlt im Ischiasnerv Axone. Der Beckenkamm Wappen können als nützliche anatomischen Landmarken, L4 und L5 DRGs ermitteln angesehen werden. Bei den meisten Mäusen ist die Facette gemeinsame zwischen L5 und L6 Wirbeln proximate Beckenkamm Wappen12. Alternat...

Verletzungen des Nervensystems verursacht durch neuronale Trauma oder verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen führen in der Regel Mängel in motorischen, sensorischen und kognitiven Funktionen. Vor kurzem wurde viel Aufwand regenerative Potenz Wiedereinsetzung in den vorigen in Erwachsenen Neuronen zur Wiederherstellung der physiologischen Functionsof verletzte Nervenzellen1,2,3gewidmet. Sensorische Neuronen in der DRG sind eine Ansammlung von Nervenzellen, die verschiedene sensorische Reize wie Schmerz, Temperatur, Touch oder Körperhaltung, an das Gehirn vermitteln. Jedes dieser Neuronen ist Pseudo-unipolar und enthält ein einziges Axon, das mit einer Erweiterung in Richtung der Peripherie und der andere Zweig in Richtung Rückenmark4gabelt. Die Erwachsenen sensorischen Neuronen in DRGs gehören ein paar Reifen Säugetier-Neuronen bekannt, deren Axone aktiv nach Verletzungen zu regenerieren. Daher sind Verletzungen von sensorischen Axonen ausgiebig als entscheidende Modell eingesetzt worden, um die Mechanismen der axonalen Regeneration in Vivozu studieren.
In Vivo gen Transfection Techniken, die in der Regel weniger zeitaufwendig, einrichten und flexibler als die Verwendung von transgenen Tieren sind, spielen wichtige Rollen im Studium der Funktionen der Gene und Signalwege im Nervensystem. Die wichtigsten Techniken können kategorisiert werden, in zwei Ansätze: Instrument und Virus-basierte5. Viral-basierte in-Vivo -gen Lieferung in Erwachsenen Neuronen bieten präzise raumzeitlichen Manipulation der Gen-Expression-6. Arbeitsintensive Prozesse sind jedoch im viral-basierte Methoden wie die Produktion und Reinigung der Viruspartikel enthält das gewünschte gen beteiligt. Darüber hinaus könnten viele virale Vektoren das Immunsystem des Wirtes, aktivieren, die stören der Datenerfassung, Datenanalyse und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse möglicherweise in die Irre führen kann. Elektroporation, ein typisches Instrument-basierte Transfektion Ansatz nutzt einen elektrischen Impuls erhöhen die Durchlässigkeit der Zell- und Kernmembran vorübergehend, der den Zustrom von Gen-Vektoren oder kleine RNS Oligos aus Raum außerhalb der Zellen7 begünstigt . In-vitro- Elektroporation ist weithin anerkannt als eine vorübergehende aber höchst effiziente Strategie für die Manipulation gezielt Genexpression in vielen Zelltypen. Obwohl nur mit geringer transfecting Effizienz im Vergleich zu viralen Vektoren in Vivo Elektroporation zu transiente Genexpression führt, hat verschiedene Vorteile gegenüber viralen Ansätzen. Zum Beispiel kann es auf fast allen Geweben und Zellen7,8,9angewendet werden. Darüber hinaus entweder Plasmide Kodierung Gene-of-Interest oder kleine RNS Oligos (z. B. SiRNAs, Micro-RNAs) gegen bestimmte Protokolle können direkt in das Zielgewebe injiziert und dann elektrisch gepulst, die machen des Verfahrens weniger Arbeit - und Zeit - Konsum. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Plasmide und RNS Oligos gleichzeitig mit einzelnen Electroporation transfecting.
Wir haben eine in Vivo Elektroporation Ansatz zur Genexpression in Erwachsenen Maus sensorischen Neuronen zu manipulieren und erfolgreich im Einsatz und Validierung solcher Ansatz in zahlreichen Pionier Studien1,2,3 ,8,10. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um die Nutzung dieses Ansatzes für zukünftige Studien der Säugetier-Axon Regeneration zu erleichtern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

Elektroporation ist eine wesentliche nicht-viralen Gen Transfektion Annäherung an DNA Plasmide oder kleinen RNA-Molekülen in Zellen bringen. Eine sensorische Neuron im Dorsal Root Ganglion (DRGs) erstreckt sich ein einziges Axon mit zwei Niederlassungen. Ein Zweig geht an die peripheren Nerven (periphere Zweig) und der andere Zweig tritt das Rückenmark durch den Dorsal Root (zentrale Niederlassung). Nach der neuronalen Verletzung regeneriert der peripheren Zweig robust während der zentralen Zweig nicht regenerieren. Aufgrund der hohen Regenerationsfähigkeit hat sensorische Axon Regeneration als Modellsystem verbreitet Säugetier-Axon Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) und das zentrale Nervensystem (ZNS) zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll über vorher festgelegten Ansatz zur Genexpression in Reife sensorischen Neuronen in Vivo über Elektroporation zu manipulieren. Basierend auf Transfektion mit Plasmide oder kleine RNS Oligos (SiRNAs oder Micro-RNAs), ermöglicht der Ansatz sowohl Verlust und Gewinn-of-Function-Experimente, die Rolle der Gene-of-Interests oder Micro-RNAs in Regulation der Axon Regeneration in Vivozu studieren. Darüber hinaus kann die Manipulation der Gene Expression in Vivo innerhalb einer relativ kurzen zeitlichen Verlauf sowohl räumlich als auch zeitlich gesteuert werden. Dieses Modellsystem bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen mit denen Säugetier-Axon Regeneration regulierten in Vivoist.

Zur Quantifizierung der Zytotoxizität des aktuellen Protokolls und zu validieren, dass Transfektion in Vivo DRG Elektroporation ist hoch genug, wir injiziert und elektroporiert eindringmittel getaggt MicroRNA oder SiRNA in L4 und L5 DRGs. Die freistehende DRGs wurden durch Cryo-schneiden und Immunohistochemistry (Abbildung 1A-B) verarbeitet. Wenn die Zelle Überlebensrate nach Injektion und Elektroporation schätzen, waren die intak...

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Laminotomie LWS Dorsal Root Ganglion-Zugriff und Injektion bei Schweinen

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...