Name: investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00
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(F q 受賞資金が供給された研究Z.) NIH (R01NS064288、R01NS085176、R01GM111514、R01EY027347)、クレイグ H. Neilsen 財団、BrightFocus 財団によって。

ジョンズ ・ ホプキンス機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された動物のプロトコルに従ってすべての動物実験を行った。
1. 材料および試薬
<ol><li>
動物
	<ol>
<li>実験のための 30-35 g の重量を量る 6 週齢雌 CF1 マウスを使用します。 注: マウスだったグループは建物 (5 マウス ケージごと) 1/4"トウモロコシ穂軸ベッド、2" 平方 nestlets ネスティングの...

<ol>
	<li>Saijilafu, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1.">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690 (2013).</li><li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration.">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li><li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression.">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1865 (2015).</li><li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain.">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li><li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line.">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li><li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Therapy+2017:+Progress+and+Future+Directions.">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li><li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields.">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li><li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration.">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543 (2011).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859 (2016).</li><li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model:+surgical+anatomy+and+operative+technique.">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li><li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery.">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li><li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice.">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li></ol>

いくつかの手術の手順には、特に注意が必要です。L4 と L5 drg コード (細胞体の位置) は、坐骨神経を支配を正しく識別され、遺伝子構造に注入する必要があります。そうでなければ、GFP 標識が休演いたします坐骨神経軸索で。腸骨稜は、L4 と L5 Drg を特定する有用な解剖学的ランドマークとして見なすことができます。L5 と L6 の椎間関節面は、ほとんどマウス腸骨稜12に近?...

神経外傷による神経系の傷害または様々 な神経変性疾患は、通常、モーター、感覚と認知機能の欠陥になります。最近では、多くの努力は、負傷した生理機能ニューロン1,2,3を復元する大人ニューロンの再生力再建に専念してきました。DRG ニューロンは痛み、温度、タッチ、または脳への姿勢など、さまざまな感覚刺激を伝達する神経細胞のクラスターです。各これらのニューロンは擬似単極、周囲に向かって拡張 1 つの支店と4脊髄に向かって他の支店を分割単一の軸索が含まれています。Drg の大人の感覚ニューロンはいくつか成熟した哺乳類神経損傷後の軸索を積極的に再生する知られています。したがって、感覚軸索の損傷広範囲として採用されている重要なモデル軸索再生の生体内のメカニズムを研究します。
生体内で遺伝子トランスフェクション技術は、通常以下をセットアップする時間がかかり、トランスジェニック動物を使用するよりもより柔軟な遺伝子の機能を勉強し、中枢神経系における情報伝達システムに必須の役割を果たしています。主な技術は、2 つの方法に分類できます: 計測器およびウイルス ベース5。大人ニューロンの遺伝子デリバリー ウイルス ベースは生体内で遺伝子発現6の正確な時空間操作を提供できます。しかし、労働集約的なプロセスは生産目的の遺伝子を含んでいるウイルス粒子の精製など、ウイルス ベースの方法で関与しています。さらに、多くのウイルスのベクトルは、データ集録、データの解析を妨げる可能性があり、可能性の実験結果の解釈を誤解するホストの免疫システムをアクティブにでした。エレクトロポレーション、典型的な楽器ベースのトランスフェクション アプローチ遺伝子ベクターまたは7 細胞外スペースから小さな RNA oligos の流入を支持の一過性細胞および原子膜の透過性を高める電気パルスを使用して、.体外エレクトロポレーションは、さまざまなタイプのターゲット遺伝子発現を操作するための一時的な非常に効率的な戦略として認識されています。体内エレクトロポレーションは、効率が低い株ウイルスのベクトルと比較しての一時的な遺伝子発現に他ならない、ウイルスのアプローチに比べて様々 な利点があります。たとえば、ほとんどすべて組織・細胞7,8,9に適用できます。さらに、特定の成績に対してどちらかのプラスミド (例えばSirna、マイクロ Rna) の興味の遺伝子または小さな RNA oligos 標的組織に直接注入でき、電気的パルス、手順にして以下の労働 - と時間のかかります。また、複数のプラスミドと単一エレクトロポレーションと同時に RNA oligos の株は、可能です。
我々 が成体マウス感覚神経細胞における遺伝子発現を操作する生体内でエレクトロポレーション アプローチを確立が正常に適用され、1,パイオニア研究多数2,3 でこのようなアプローチを検証 ,8,10。ここでは、哺乳類の軸索の再生の将来の研究のためのこのアプローチの使用を容易にするために詳細なプロトコルを提案する.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1039px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">ECM 830 Square wave electroporation system</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0052</td>
			<td style="width:351px;">For in vivo electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:335px;">Tweezertrodes electrodes</td>
			<td style="width:232px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:121px;">45-0524</td>
			<td>For in vivo electroporation, 1 mm flat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:232px;">Parker Instrumentation</td>
			<td style="width:121px;">1096</td>
			<td>Intracellular Microinjection Dispense Systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary Puller</td>
			<td style="width:232px;">NARISHIGE</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">1902328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Stereo Dissection Microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica</td>
			<td style="width:121px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Rongeur</td>
			<td style="width:232px;">F.S.T</td>
			<td style="width:121px;">16221-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Microsurgery Forceps</td>
			<td style="width:232px;">FST by DUMONT, Switzerland</td>
			<td style="width:121px;">11255-20</td>
			<td>Only for sciatic nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass Capillary</td>
			<td style="width:232px;">World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td style="width:121px;">TW100-4</td>
			<td>10 cm, standard wall</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tape</td>
			<td style="width:232px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:121px;">15-901-30</td>
			<td>For fixing the mouse on the corkboard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">T48402</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-methyl-2-butanol</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">152463</td>
			<td>Avertin stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">SIC003</td>
			<td>Non-target siRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:335px;">microRNA Mimic Transfection Control with Dy547</td>
			<td style="width:232px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:121px;">CP-004500-01-05</td>
			<td>Non-target microRNA with fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Plasmids preparation kit</td>
			<td style="width:232px;">Invitrogen Purelink</td>
			<td style="width:121px;">K210016</td>
			<td>GFP-coding plasmid preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fast Green Dye</td>
			<td style="width:232px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F7252</td>
			<td>For better visualization of the DRG outline during injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Ketamine</td>
			<td style="width:232px;">Putney, Inc</td>
			<td style="width:121px;">NDC 26637-731-51</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Xylazine</td>
			<td style="width:232px;">AnaSed</td>
			<td style="width:121px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Acetaminophen</td>
			<td style="width:232px;">McNeil Consumer Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">NDC 50580-449-36</td>
			<td>Post-surgical pain relief</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mammalian axon regeneration: in vivo electroporation of adult mouse dorsal root ganglion

エレクトロポレーションは、DNA プラスミッドまたは小さな RNA 分子を細胞に導入する本質的な非ウイルス性遺伝子導入アプローチです。後根神経節 (Drg) の感覚ニューロンは、2 つの分岐の 1 つの軸索を拡張します。1 つの分岐は、周辺機器に行く神経 (末梢枝) と他の支店 (中央支部) 後根を介して脊髄に入る。神経損傷後末梢枝は中央支店、再生成しないに対し力強く再生されます。ため高い再生能力感覚軸索の再生は広く使用されてモデル システムとして末梢神経系 (PNS)、中枢神経系 (CNS) の両方で哺乳類の軸索の再生を研究します。ここでは、成熟したニューロンの生体内でエレクトロポレーションによる遺伝子発現を操作する以前に確立されたアプローチ プロトコルについて述べる。アプローチ芳司プラスミッドまたは小さな RNA oligos (Sirna またはマイクロ Rna) に基づき、遺伝子の利益または軸索再生の生体内の調節におけるマイクロ Rna の役割を検討する両方の損失と利得-の機能実験のためことができます。さらに、空間的そして一時的は比較的短時間で遺伝子発現の体内操作の制御ができます。このモデル系は、哺乳類の軸索の再生が規制生体内では分子メカニズム解明のためのユニークなツールを提供します。

L4 と L5 Drg に DRG エレクトロポレーション体内のトランスフェクション率は十分に高く、注入我々 を検証し、現在のプロトコルの細胞毒性や electroporated 蛍光タグ付きマイクロ Rna、siRNA を定量化します。戸建の Drg を用いて電子顕微鏡や免疫組織化学 (図 1A B) 経由で処理されました。注射エレクトロポレーション後の細胞生存?...

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Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

エレクトロポレーションは、興味の遺伝子を細胞に提供する効果的なアプローチです。このアプローチは生体内で成体マウス後根神経節 (DRG) のニューロンに適用すると、軸索再生の生体を研究するためのモデルについて述べる。

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

腰部後根神経節のアクセスと豚注入の椎

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のin vitro髄鞘形成

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...